SN 1447.2-2005猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1447.2--2005猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction(PCR) for Actinobacilluspleuropneumoniae2005-02-17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布数码防伪，国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1447.2--2005前 言本标准的附录 A为规范性附录,附录 B、附录 C 为资料性附录。本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李树清、胡永强、李健、王巧全、陈志飞。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1447.2--2005猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应操作规程范围本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌聚合酶链式反应方法。本标推适用于猪胸膜肺炎放线杆菌的鉴定和检测。2缩略语下列缩略语适用于本标。APPActinobacillus pleuropneumoniae胸膜肺炎放线杆菌PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应3原理APP有2个生物型15个血清型，所有血清型都在体内表达ApxIVA毒素。针对apαIVA毒素基因的保守序列，设计特异的 PCR引物可以扩增所有血清型的 APP。根据 APP的 aprIVA毒素基因设计的特异引物P1/P4和放线杆菌16SrRNA的序列设计的通用引物S7/S10，组成的复合PCR可扩增出363bp和692bp的片段，用于猪胸膜肺炎放线杆菌的检测。为提高检测的敏感性，又在P1/P4的两侧内部设计了特异引物P6/P8，组成套式PCR，可扩增出223bp的片段。设备和材料414.1仪器设备4.1.1 PCR扩增仪。4.1.2电泳仪。凝胶成像系统。.4微波炉。4.1.5可调移液器。4.1.6离心机。4. 1.7勾浆器。4.1.8 天平。4.2耗材4.2.1 PCR反应管。mL离心管。4.2.3移液器滴头。4.3试剂4.3.1三蒸水 0.103 MPa 灭菌 15 min。4.3.2吐温-20(Tween-20)0.103 MPa 灭菌 15 min。4.3.3琼脂糖。4.3.4溴化乙锭。4.3.5Taq酶。 SN/T 1447.2--20054.3.625mmol/L氯化镁。4.3.7 2.5 mmol/L dNTP。4.3.8分子量指示物:100 bp～2 000 bpDNA marker。4.3.9PBS、Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)、琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液的配制及10XPCR缓冲液见附录A。4.4引物引物见表1。表1 引物引物核苷酸序列引物浓度/(μmol/L)产物大小/bp5S75 -ctagggaggggtagaatt-3S10b55692gattactagcgattccgactt-3*P1a55 -cgtaactcggtgattgatgc-3P4b53635 -cgtttgctcattcgataaacg--3P6a5* -gtgcgggtaatgatacggtt-355223P8b5*-cggctaaaccaaagttcggat—3a上游弓引物 forward primer。b下游引物 reverse primer。5操作步骤5.1样品被检菌株、扁桃体、肺等组织样品及鼻拭子。5.2样品处理5.2.1菌株挑取可疑菌落于 pH7.2 0.01 mol/L PBS 中，制成约 108菌悬液（液体稍浑浊），再用 PBS进行10倍、100倍稀释。原液、10倍和100倍稀释液均作为复合PCR扩增的模板。5.2.2组织样品及鼻拭子取组织0.5 g～1 g剪碎,加人 1 mL PBS缓冲液,勾浆。鼻拭子在 1 mL PBS缓冲液中反复挤压。分别将挤下的液体和组织匀浆液100Xg离心5 min,弃沉淀。上清10 000 g离心5min,弃上清。沉淀加人50 μLPBS和1μL灭菌Tween-20，一20℃冷冻15 min,取出立即置100℃水浴中煮沸5 min，重复冻融、煮沸两次。10000g离心5min，留上清，取部分上清进行10倍、100倍稀释。原液、10倍和100倍稀释液均作为套式 PCR扩增的模板。APP阳性和阴性组织进行同样的处理。5.3 复合 PCR5.3.1对照设立阳性对照用胸膜肺炎放线杆菌标推菌株 DNA。阴性对照用林氏放线杆菌(Actinobacillus lignieresi)菌株DNA。空白对照用等体积的水代替模板。APP菌株的培养参见附录 B。DNA的提取参见附录 C。5. 3. 2 PCR 反应体系总体积30μL,10×PCR反应缓冲液3μL;氯化镁3μL;dNTP3μL;