SN_T 3567.7-2017交叉引物恒温扩增检测方法 第7部分：肠道病毒71型.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3567.7--2017交叉引物恒温扩增检测方法第7部分:肠道病毒71 型Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 7 :Enterovirus 71(EV71)2017-07-21发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪 SN/T3567.7—2017前 創言SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分：第1部分：通用技术规程；第2部分：霍乱弧菌；第3部分：大肠杆菌0157：H7；第4部分：黄热病毒；第5部分：沙门菌属；第6部分：结核分枝杆菌；第7部分：肠道病毒71型；第8部分：原虫；第9部分：鼠疫耶尔森菌；第10部分：炭疽芽孢杆菌；第11部分：志贺菌。本部分为SN/T3567的第7部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：李智慧、柴宏森、田卉、祁军、胡林、尤其敏。 SN/T3567.7—2017交叉引物恒温扩增检测方法第7部分：肠道病毒71型1范围SN/T3567的本部分规定了在国境口岸肠道病毒71型交叉引物恒温扩增法检测的对象、检测程序及检测结果报告。本部分适用于在国境口岸对肠道病毒71型的快速筛查检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部2006）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1交叉引物恒温扩增技术crossprimingisothermalamplification；CPA一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的RNA聚合酶（RNAPolymerase)外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该RNA聚合酶的高活性的链置换特性，使RNA的循环扩增能不断地实现。3.2交叉引物crossprimer用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.3剥离引物bumperprimer位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。3.4检测引物detectionprimer一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光索标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。1 SN/T3567.7--20173.5BstDNA聚合酶BstDNApolymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus)DNA聚合酶的部分片段，保留了其5→3DNA聚合酶活性，但是去除了5-→3核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（StrandDisplacement)。4缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）5生物安全措施实验操作及处理按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质的工作人员进行。所有废弃物处理也应按照GB.19489中的有关规定执行。6检测对象肠道病毒71型感染病例或疑似肠道病毒71型感染者的咽拭子、粪便。7试剂和材料7.1除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。7.2RNA提取试剂：RNA提取试剂盒。7.310×ThermoPol缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100 mmol/L(NH.)2SO4、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO.、1%TritonX-100。7.410mmol/Ld