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超声辅助酶法提取克氏原螯虾虾黄油脂及其脂肪酸组成分析 嗜水性生龙虾的学名是cryfish。这是中国最早的淡水冷杉之一。它低脂、低胆固醇、丰富的肌球蛋白、矿物和脂溶性维生素。 动植物油脂提取的方法有有机溶剂法 1 材料和方法 1.1 水产食品有限公司 虾黄 (鲜虾水煮后、去壳、取虾黄, 用塑料袋真空密封后存放于-20℃冰箱中) 顺祥水产食品有限公司;蛋白酶制剂 (中性蛋白酶≥50 U/mg、酸性蛋白酶≥50 U/mg、碱性蛋白酶≥200 U/mg、木瓜蛋白酶≥200 U/mg、复合蛋白酶≥120 U/mg) 上海楷洋生物技术有限公司;三氯甲烷、无水乙醇、磷酸氢二钾等为分析纯。 1.2 仪器、检测设备 TD5A型离心机湖南赫西仪器装备有限公司;KQ-2500E型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;WFJ7200型可见分光光度计尤尼柯仪器有限公司;RE52-3旋转蒸发器上海沪西分析仪器厂有限公司;KDN-103F自动定氮仪上海仟检仪器有限公司;电热恒温水浴锅北京市永生明医疗仪器厂。GC-2010PLUS气相色谱仪 (配FID检测器) 美国安捷伦公司。 1.3 方法 1.3.1 超声波提取法 冰冻虾黄解冻后, 准确称取10 g匀浆虾黄至于150 m L锥形瓶中, 加入一定量蒸馏水, 在电动搅拌器上加热并用磷酸缓冲液调至相应p H值, 添加蛋白酶, 在已设置好超声温度、时间和功率的超声波清洗器中进行提取。酶解一段时间后转移酶解液于离心管中, 5 000 r/min离心15 min。离心结束后, 将酶解液至于-20℃条件下冷冻过夜, 40℃解冻离心以破乳 1.3.2 计算虾油提取率的计算 1.3.3 超声辅助酶法提取虾黄油条件优化 1.3.3. 超声时间和温度影响对虾黄油脂提取率的影响有以下几种 按照1.3.1节方法提取虾黄油脂, 研究添加不同质量分数的蛋白酶 (0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%) 、p H值 (6.0、6.5、7.0、7.5、8.0) 、水料比 (1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1) 、超声酶解温度 (35、40、45、50、5 5℃) 、超声功率 (0、5 0、7 5、1 0 0、1 2 5、1 5 0、175 W) 、超声时间 (60、90、120、150、180 min) 对虾黄油脂提取率的影响。 1.3.3. box-behnken试验设计响应面试验 综合单因素试验结果, 用SPSS软件进行方差比较和多重分析, 排除没有显著性影响的试验因素, 利用Design-Expert 7.0软件按照Box-Behnken试验设计原理设计响应面试验。 1.3.3. 不同因素对克氏原螯虾虾黄的提取率影响,有以下几种基因型的检测 以提取分离的虾黄油脂为原料, 进行脂肪酸成分分析, 参照GB/T 9695.2—2008《肉与肉制品:脂肪酸测定》的方法进行脂肪酸的甲酯化。 气相色谱条件:色谱柱:S P-2 5 6 0 (1 0 0 m×0.25 mm, 0.2 mm) ;进样口温度:230℃, 检测器温度:250℃, 程序升温:初始温度120℃保持3 min, 以3℃/min升至230℃保持15 min;以5℃/min升至235℃保持3 min, 分流比为50∶1, 进样体积1 m L, 柱流量1.0 m L/min。面积归一法确定脂肪酸的百分含量。 如图1所示, 蛋白酶水解克氏原螯虾虾黄后, 油脂提取率由高到低依次为:复合蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。同时, 通过方差分析和多重比较结果显示, 添加蛋白酶的5组试验提取率与空白组都有显著性差异。这是由于不同蛋白酶作用于蛋白质的位点不同, 催化活力不同造成的 2.1.2 复合蛋白酶添加量 如图2所示, 随着复合蛋白酶添加量的增加, 虾黄油脂的提取率呈现先增加后降低的趋势, 并在添加质量分数0.6%的复合蛋白酶时有最大值。这可能是由于当添加量低于质量分数0.6%时, 随着酶解反应的进行, 蛋白酶破坏蛋白质和油脂结合的效果也随之增强;而当添加量高于质量分数0.6%的时, 底物由大分子球状集团变成小分子链状结构, 降低了反应表面积, 同时酶自身也存在一定的水解, 使得蛋白酶活力降低 2.1.3 复合蛋白酶添加量对油脂分子释放率的影响 如图3所示, 通过方差分析和多重比较结果显示, 在p H值为6.0~8.0的范围内, 虾黄油脂的提取率并没有显著性差异 (P0.05) , 说明复合蛋白酶在p H值在6.0~8.0的范围内均能作用于底物相应位点并发挥催化活性, 使油脂分子释放出来。同时经测定, 原料的p H值为7.0~7.5, 综合考虑, 选择在原料自然初始p H值环境下进行酶解反应, 既可以保证提取效果, 也避免了加入缓冲液带入的杂质。 2.