NY_T 2960-2016兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2960—2016兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法Detecting method for rabbit haemorrhagic disease virus by RT-PCR2016-10-26发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2960—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济学院。本标准主要起草人：邵卫星、王芳、魏荣、胡波、徐耀辉、魏后军、孙映雪、李卫华。I NY/T2960—2016兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了检测免病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法的技术要求本标准适用于检测疑似兔病毒性出血病肝脏、脾脏、肺脏等脏器及鼻腔分泌物的兔病毒性出血病病毒核酸。2缩略语下列缩略语适用于本文件。EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）。(O)ligod(T)18Primer：含有18个T的寡聚核苷酸。RHD:兔病毒性出血病。RNA：核糖核酸（ribonucleic acid)）RT-PCR：反转录一聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）。Taq酶：TaqDNA聚合酶（taqDNApolymerase）。TBE：Tris-硼酸电泳缓冲液。bp：碱基对（basepair）。dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）。3仪器设备3.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000×g以上。3.2PCR扩增仪。3.3核酸电泳仪和水平电泳槽。3.4恒温水浴锅。3.52℃～8℃冰箱和一18℃以下冰箱。3.6微量移液器（0.5ul~10μL；2μ～20μl；20μl200μl；100μl~1000μl）。3.7凝胶成像系统（或紫外透射仪）。3.8生物安全柜。4试剂4.1AMV反转录酶或其他反转录酶。4.2RNA酶抑制剂。4.3TugDNA聚合酶。4.4dNTPs。4.5TRIZOILRNA提取试剂。4.61.0%琼脂糖凝胶.见A.1。4.75×TBE缓冲液.见A.2。4.8DNA染料：溴化乙锭（EB）。1 NY/T 2960—2016警告：电泳中用到的EB可诱发基因突变，在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并进行无害化处理。4.9焦碳酸二乙酯（DEPC）水.见A.3。警告：DEPC对眼睛和呼吸道黏膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。4.10异丙醇：一18℃以下预冷。4.1175%乙醇：-18℃以下预冷4.12氯仿警告：氯仿毒性属中等毒性，吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黏膜刺激症状，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。4.13DNA分子量标准（DI2000DNAMarker）。4.146×电泳上样缓冲液。5引物5.1反转录引物见B.1。5.2PCR引物见B.2。6操作程序6.1样品的采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染，采样、样品处理及RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩6.2样品的采集及处理6.2.1肝脏等脏器的采集和处理无菌取疑似RHD死亡兔肝脏等脏器5g，分别剪碎作为检测样品。同时以RHD死亡兔和正常兔肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品，同样处理。一18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6.2.2鼻腔分泌物的采集和处理用DEPC水润湿棉签拭子，深入兔鼻腔内部涂抹数次，然后放到含O.2mLDEPC水的EP管中。一18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。6.3RNA的提取6.3.1TRIZOL法实验室没有商品化RNA提取试剂盒采用此方法将5倍样品量的DEPC水加入脏器组织中.研磨成悬液.装人DEPC处理过的EP管中，一18℃以下反复冻融3次，5000g离心5min.取200ul.上清液作为待提取样品（浸泡于EP管中的棉签拭子，经反复挤压5次后.5000g离心5min.取200μl上清液作为待提取样品）。然后.加人700ulTRIZL.振荡混匀后.室温放置10min.加入氯仿300ul。振荡混匀后.室温放置30min，4℃10000g离心15min。取上层水相600ul.加人等体积的异丙醇.混匀，一18℃以下放置2h以上或过夜.4℃10000g离心15min.去上清液，缓缓加人75%乙醇1ml.洗涤，4℃5000g离心5min，去上清液室温干燥20min.加人DEPC