微生物实验室的菌种鉴定.pdfVIP

微生物实验室的菌种鉴定 微生物检验过程中检出的微生物应该进行微生物鉴定，虽然药典里明 确了鉴定到什么水平的标准和一些基础内容操作方法。但是因为实验 室能力有限，很多实验室要么消极抵抗要么稀里糊涂的要么完全委 外。 其实我们一般微生物实验室自己还是可以做一些工作，特别是细菌的 鉴定。再就是菌种鉴定时，不是直接拿来就鉴定，需要一些预先做一 些处理或判断。现将一些基础知识进行总结如下： 一、相关定义 1、生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、 渗透压）、生化指标（唯一碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应 进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与 已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定的一种技 术。 2、革兰氏染色：系细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细 菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些 结构特征，而用以分类鉴定。 3、平板划线法：系指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单 菌落的方法。 4、氧化酶试验：氧化酶不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞 色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜 色反应而进行的试验，用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性） 和肠道菌（氧化酶阴性）。 5、触酶试验：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌 属阴性，故常用此试验来鉴定，用于区分葡萄球菌(过氧化氢酶阳性） 和链球菌(过氧化氢酶阴性）。 6、凝固酶试验：用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测为非致病性） 和凝固酶阳性葡萄球菌(很可能为致病性）。 二、工作程序 1、微生物鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时一般先将待检菌 进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴 定，根据所需要达到的鉴定水平选择鉴定方法。目前实验室室进行表 型微生物鉴定后可以用API试剂条进行或其他等效的试剂条进行菌 种鉴定，如API试剂条鉴定不能满足要求时采取委外鉴定。 注：为了控制成本，可以自己进行鉴定，不具备能力时再委外。API 鉴定用的试剂条的效期有限，需要注意效期或跟供应商做好沟通备 货。 1.1待检菌的分离与纯化 微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化，最常用的分离纯化方 法是挑去待检菌的纯培养物（单个菌落），必要时可进一步进行纯培 养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量的菌体。从药物原材料、 制药用水、生产环境、中间产品和最终产品的样品中检出的受损微生 物，经分离纯化程序使其由不利生存易产生变化的状态变为在营养富 集和最佳培养温度条件下生存的稳定状态，以保证鉴定结果的准确 性，具体详见表1。 表1待检菌的分离与纯化明细表 1.1.1平板划线法 平板划线方法一般通过连续画蛇形曲线或四区划线方法进行。四区划 线具体步骤如下：先在平皿上做好标识，然后在选择所获得的新鲜菌 种进行划线；左手持无菌平板，拇指和食指控制皿盖，其余指控制皿 底，打开皿盖，用接种环在皿上进行划线，一区要连续紧密的几根平 行线（如果菌量过多可以更换接种环），二区紧着着一区的最后一根 线带出来，划几根平行线，然后三区、四区同样的操作，四区应尽量 避免接触到菌落密集区，影响单菌落的形成；最后再选择适宜的温度 进行培养。 1.1.2稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000）， 然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养 基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能 含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。 如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌 落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个 菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.1.3涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏 感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在 琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种 分离方法是涂布平板法。 其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却 固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将 菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。 1.2初筛实验 常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物 特征，将待检菌进行初步分类。常见的初筛试验包括革兰氏染色、芽 孢染色、镜检观察染色结果和