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心肌组织总rna提取方法的探索 总氮提取和提取技术是阐明分子量的基础。广泛使用自然资源的分子研究方法如工会和细胞。因此高纯度及完整的总RNA的提取及纯化至关重要。心肌组织属于富含内源性RNA酶的脏器 1 材料和方法 1.1 高效液相色谱法trizel-pcr法 昆明小鼠20只, 4~6周龄, 雌雄各半, 20~25g, 购自北京大学实验动物中心。DEPC (SIGMA公司) , EB (Sigma公司) , Trizol试剂 (Invitrogen公司) , 离心柱型高纯度总RNA快速提取试剂盒 (北京百泰克生物技术有限公司) 。氯仿, 异丙醇, 75%和100%乙醇, 琼脂糖, 液氮, Nanodrop定量分析仪, Eppendorf低温高速离心机, 电泳仪, 凝胶成像仪, 手术器材, 研钵等。所有溶液均用DEPC水制备;EP管、移液枪头均用DEPC水处理并高压灭菌;所有陶瓷、玻璃及金属制品采用180℃, 6 h高温灭菌。 1.2 方法 昆明小鼠使用乙醚麻醉, 快速取出心肌组织, 称重, 剪成小块, 置于冻存管中, 放入液氮罐备用。1周后取出组织块按下面3种方法操作。 1.2.1 样品溶液的制备 ①将心肌组织放入盛有液氮的研钵中, 边加液氮边研磨, 直至组织呈粉状, 再加入50 mg组织/1 ml Trizol试剂继续研磨, 待液氮挥发后。②用移液器反复吹打数次, 装入EP管中。③按Trizol法说明书进行, 室温静置5 min, 12 000 r/min, 离心5 min;按200μl氯仿/1 ml Trizol加入氯仿, 室温静置15 min;4℃, 12 000 g离心15 min;吸取上层水相, 按0.5 ml异丙醇/1 ml Trizol加入异丙醇, 室温放置10 min;4℃, 12 000 g离心10 min, 弃上清;1 ml 75%乙醇漂洗, 4℃, 8 000 g离心5 min, 室温晾干, 50μl DEPC水溶解, 置于-20℃备用。 1.2.2 剪切碎法切割法 ①将心肌组织置于0 ml离心管中, 加入冷Trizol试剂, 用眼科剪在冰浴中充分剪碎组织。②、③同研磨法的②、③。 1.2.3 dnasereationmort-pcr检测 ①将心肌组织 (20~30 mg) 放入盛有液氮的研钵中, 边加液氮边研磨, 直到组织呈粉未状, 加入350μl RA1继续研磨, 液化后置于离心管中加入1%二疏基乙醇, 静置数分钟。②按试剂盒说明书进行, 粉柱过滤, 11 000 g, 1min;加入与RA1等体积70%乙醇, 震摇5 min;蓝柱过滤, 11 000 g, 1 min;600μl MDB, 11 000 g, 1min;100μl DNAse reation mixture, 室温15 min;RA2及RA3洗脱并干燥, 50μl DEPC水溶解, -20℃备用。 1.3 grna的pcr检测 取2μl制备的RNA溶液于Nanodrop定量分析仪检测, 记录样本浓度、260/280比值、260/230比值;另取0.5μg RNA于5%琼脂糖凝胶电泳, 电压120 V, 17 min。凝胶成像系统分析, 保存图像。 2 3/400 定量分析结果示:过柱法与研磨法提取的总RNA 260/280、260/230比值比较稳定, 260/280介于1.9~2.0之间, 260/230介于1.3~1.6之间;剪碎法260/280比值介于1.7~2.0之间, 260/230则差异较大, 0.5~2.0之间都有。详见图1。 3 采用研磨法和过柱法提取rna 组织RNA抽提要避免RNA的降解和组织内杂质的残留, 由于组织中含有RNA酶, 因此避免RNA降解是首要问题 总之, 研磨法仍为组织总RNA提取的主要方法, 过柱法目前由于价格较贵, 对于小量的组织块较为适合, 剪碎法对于条件稍差地区开展分子生物学实验, 提取RNA仍为可取的方法。