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不同提取液对菜心叶片叶绿素提取效果和稳定性的影响 叶色是植物叶片的主要光合色彩，叶色含量是植物生理研究的重要指标。 1 材料和方法 1.1 试验材料 菜心叶片;上海光谱仪器有限公司生产的723PC型可见分光光度计;丙酮、乙醇都为分析纯, 95%乙醇直接采购。 1.2 浸提法提取叶片 按体积比配制浸提液, 设6个处理, A:95%乙醇;B:80%丙酮;C:丙酮∶乙醇=1∶1;D:丙酮∶乙醇=1∶2;E:丙酮∶乙醇=2∶1。A、B、C、D、E处理采用浸提法, 以Arnon法作为对照。 将新鲜菜心叶片洗净, 用吸水纸吸干表面水分, 去大叶脉后, 将叶片剪碎成约0.2 cm×1.0 cm的小细丝, 混匀备用。 Arnon法:称取0.1 g上述样品, 放入研钵中, 加入少量石英砂和80%丙酮研磨, 定容至20 ml, 过滤, 取滤液在645和663 nm波长下测定吸光度。重复3次。 浸提法:称取0.1 g上述样品, 放入50 ml的塑料管中, 分别加入上述5种不同的浸提剂20 ml。在室温暗室下浸提约24 h, 用肉眼观察叶组织完全变白, 即说明浸提完全, 分别以提取试剂为对照, 在645和663 nm波长下测定吸光度。每处理重复3次。 为研究叶绿素在各个提取液中的稳定性, 分别在第1、2、5、8天重复测定各个处理中叶绿素a和叶绿素b的含量。 1.3 叶绿素含量的处理 研究表明, 各参比浸提液的吸收光谱基本相似, 即所有浸提液的叶绿素溶液的化学性质基本相同, 叶绿素含量采用Arnon法的修正公式。用Microsoft Office Excel 2003及SAS9.0统计软件处理数据。按Arnon公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量及叶绿素总量。 式中, A 2 结果与分析 2.1 两种方法提取叶绿素 从表1可明显看出, 不同提取方法对菜心叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量有极显著性影响 (P0.01) 。C与E处理提取的叶绿素总量差异不显著, 含量较高, 分别为1.489和1.535 mg/g, 显著高于对照;其次为D和B处理, 叶绿素总量分别为1.401和1.381 mg/g;Arnon研磨法得到的叶绿素总量最低, 为1.170mg/g。 单独用丙酮、乙醇浸提液提取或丙酮研磨法, 效果均不如混合浸提液效果好。这可能和丙酮与乙醇间存在协同萃取效应有关, 促进了叶绿素的快速提取。丙酮研磨法提取效果最差, 可能与研磨和过滤过程中不可避免的损失有关。 2.2 丙酮提取速度对第8天叶绿素总量的影响 用不同提取溶剂提取的菜心叶片叶绿素, 在室温下放置1、2、5、8 d后测定提取液中叶绿素含量, 结果见表2。从表2可以看出, 除了B处理外, 其他处理的叶绿素a、叶绿素b及总量均随时间变化呈下降趋势;B处理叶绿素a、叶绿素b及总量在第2天达到最大值, 这可能是由于丙酮提取速度较慢引起的。 叶绿素提取液放置8 d后, 叶绿素a下降了1.76%~8.31%, 叶绿素b下降了1.50%~5.60%, 叶绿素总量下降了1.69%~7.44%。说明在这些提取液中, 叶绿素b比叶绿素a稳定。处理E在第8天叶绿素总量仅下降1.69%, 为最低;Arnon法提取的叶绿素总量第8天下降最高, 为7.44%。方差分析显示, 各个处理在第1、2天测定的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量差异不显著, 说明放置2 d不影响叶绿素含量, 但叶绿素提取液不宜长时间放置。 试验结果表明, 叶绿素在不同提取液中稳定性的大小依次为:丙酮∶乙醇=2∶1丙酮∶乙醇=1∶2丙酮∶乙醇=1∶1丙酮乙醇Arnon法。这说明, 单一浸提剂所得叶绿素含量较低且不稳定, 而混合液浸提叶绿素含量较高且较稳定。 3 不同提取方法的提取效果 室温下, 采用不同比例的丙酮、乙醇混合溶剂提取菜心叶片中叶绿素。试验结果表明, 浸提法要优于研磨法;浸提法中混合液提取叶绿素, 比单独用乙醇或者丙酮浸提液提取效果好。当丙酮与乙醇的体积比为2∶1时, 提取最为充分, 这与麻明友等 混合液浸提法不但所得叶绿素含量高于研磨法, 且稳定性也优于研磨法。随时间的延长, 各种提取方法均为叶绿素a降解值远远大于叶绿素b。说明叶绿素a降解速度快于叶绿素b, 这与杨敏文等的研究结果一致 丙酮与乙醇体积比为2∶1时直接浸提菜心叶片叶绿素的主要优点是步骤简单, 操作方便, 省略研磨、冲洗、离心或过滤等步骤, 节省时间, 稳定性好, 这对于快速测定大批量样品叶绿素含量具有实际意义。