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克氏原螯虾hsp70的遗传毒性研究 热休克蛋白（hsds）是一种广泛存在于真核和原核细胞中的非常保守蛋白质，分为许多家族。其中，hsp70家族是最重要、最复杂的蛋白质。主要以“分子伴侣”的形式，帮助新生儿候鸟的折叠、运输、恢复和重复使用新多年生。此外，它在保护和抗癫痫药物方面也发挥着重要作用。 甲壳动物是一类重要的水生无脊椎动物, 它们大多具有重要的经济价值和商业前景, 已成为很多国家和地区争相养殖的对象, 然而它们的生存在很大程度上受到了许多环境因素的影响, 包括温度、缺氧、重金属离子、感染、饥饿等, 这些因素与体内热休克蛋白的表达水平有紧密联系。克氏原螯虾 ( 材料和方法 质量评分 克氏原螯虾购自广州市黄沙水产市场, 体长为8 cm± 1.5 cm。实验前于水族箱中暂养2周, 水温保持在20℃左右, 每日喂食2次, 待其状态稳定, 选取蜕皮间期的虾用于实验。 组织表达实验 克氏原螯虾35℃ (预实验测定该温度约为亚致死温度) 热休克2 h, 室温恢复1.5 h, 取其心脏、肌肉、血液、消化腺、触角腺、精巢、肠共7种重要组织作为组织表达实验的材料, 取未经热休克的虾作为对照。 克氏原螯虾35℃热休克1, 2, 4, 6, 8 h, 室温恢复1.5 h, 取其心脏组织。未经热休克的虾作为对照。 经过总工会提取和合成 将各组织样品经液氮冷冻研磨后, 按照Trizol (Invitrogen) 的操作说明提取总RNA。从虾体抽血方法参照文献 pcr产物的回收及分析 参考Gilliland等 P-F3:5′-GGTGTTGGTGGGAGGGTCTA-3′; P-CP:5′-GGCTCGCTCTCCCTCATACACTACTT-GCTGTTGCTTGGTT-3′。 PCR扩增条件为:预变性94℃ 4 min, 变性94℃ 30 s, 退火59℃ 30 s, 延伸72℃ 30 s, 共35个循环, 最后72℃ 8 min。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后回收。该片段相当于在P-F3和P-R1 (nt 1004～1346, 共343 bp) 片段内部产生一个42 bp的缺失。通过连续2倍稀释配制系列浓度的scHSP70 cDNA标准, 将这些竞争标准HSP70 cDNA梯度液1 μL分别加入到0.2 μg的cDNA组织样品中, 再用引物P-F3和P-R1 (5′-GGCTCGCTCTCCCTCATACAC-3′) 同时扩增组织样品中的scHSP70 cDNA和作者制备的用于定量的竞争标准HSP70 cDNA competitor。PCR反应条件同前所述。PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后用凝胶成像系统Gel Doc XR system (Bio-Rad) 及相关软件Quantity One进行分析。样品scHSP70 cDNA带 (343 bp) 与竞争标准cDNA带 (301 bp) 可根据片段大小不同而区分并定量, 与样品scHSP70 cDNA带亮度比为0.9～1.1的竞争标准HSP70 cDNA带被用于确定组织样品中scHSP70 cDNA的含量, 再通过样品HSP70 cDNA的PCR产物分子数量将其含量换算成HSP70基因mRNA数量。 数据分析 用3个平行重复实验的平均值±标准差表示克氏原螯虾scHSP70 mRNA表达量, 数据分析用SPSS软件包LSD法进行多重比较, 当 热休克对schsp60基因表达的影响 克氏原螯虾组织样品scHSP70 cDNA竞争性PCR的代表性结果见图2。scHSP70 cDNA的产物 (343 bp) 与用于定量的竞争标准cDNA的PCR产物 (301 bp) 经2.5%琼脂糖凝胶电泳可很好地分开, 并显示该心脏样品scHSP70 cDNA的含量与竞争标准3.2×10 由表1可见, scHSP70 mRNA热休克前后在各组织中均有所表达。热休克前, scHSP70 mRNA在7种组织中表达量均相对较低。经过2 h热休克处理, 表达量均显著上升 ( 从图3中可以看出, 心脏组织在经过1 h的热休克, scHSP70 mRNA的表达量已经有明显的增加, 说明scHSP70基因在应激条件下, 能够快速启动转录和翻译, 从而起到对细胞的保护作用。而且, 表达量随着热休克时间的延长, 呈现增强的趋势, 提示scHSP70对细胞发挥一种连续性的保护作用。 水生动物hsps的表达 热休克蛋白 (HSPs) 是进化上高度保守、功能上至关重要的一类蛋白, 它广泛存在于从低等原核生物到高等哺乳动物的整个生物界。正常情况下, 热休克蛋白主要行使分子伴侣功能, 并参与蛋白质代谢、细胞周期调控、细胞凋亡等重要的生命活动 迄今, 水生动物HSPs的研究主要集中在鱼类, 仅从少数几个种的鱼类中克隆得