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pmaa转化枯草芽孢杆菌ob105菌株的诱变选育 干旱芽（pgp）是植物根系的一个重要菌株。它存在于植物根系的表面、根周长和根周长，以及与植物共生的根间。它不仅具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力,而且在植物根部施用可显著促进植物生长。枯草芽孢杆菌OKB105菌株对防治辣椒病毒病和烟草花叶病毒病均有较好的效果,并且能够诱导植物促生相关基因的表达,温室施用可以显著提高烟草株高和鲜重。目前,虽然枯草芽孢杆菌的生防优势越来越明显,但是芽孢杆菌在植物根部定殖和促进植物生长的分子作用机制尚不清楚。 在大量的分子遗传研究方法中,转座子随机诱变技术因操作简便而备受关注。转座子及其衍生物作为插入突变原或分子标签已被广泛应用于基因的分离和克隆当中,特别是某些具有随机转座特性的转座子,已成为发现新基因,克隆功能基因,发掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具。Himar1转座元件是从角蝇(Haematobia irritans)中分离得到的,与其他转座子相比,具有转座频率高、插入位点随机性高的突出优点。本研究主要利用Himar1转座诱变体系构建OKB105菌株的突变体文库,其中,pMarA是专为随机诱变芽孢杆菌而设计的穿梭载体,携带有TnYLB-1转座子、高温敏感的芽孢杆菌复制子以及依赖σA启动子引导的Himar1转座酶。50 ℃高温诱导条件下,pMarA质粒无法复制,在Himar1转座酶的催化作用下,TnYLB-1转座子可以插入到枯草芽孢杆菌基因组任意的TA序列中,导致基因被随机诱变失活。 本文研究了适合B.subtilisOKB105菌株感受态细胞转化pMarA质粒的方法和条件。通过转座子TnYLB-1对B.subtilisOKB105进行随机突变,并成功构建了该菌株的突变体文库,为下一步通过生物检测等方法筛选与该菌株定殖、促进植物生长及生防相关基因提供了基础。 1 材料和方法 1.1 枯草芽孢杆菌转化子 枯草芽孢杆菌OKB105菌株及其突变体、大肠杆菌DH5α均在LB培养基(Luria broth)上37 ℃条件下培养;枯草芽孢杆菌转化子OKB105-MA在LB培养基上30 ℃条件下培养。所用抗生素及其浓度如下:氨苄青霉素100 μg·mL-1,红霉素10 μg·mL-1,卡那霉素5 μg·mL-1。供试菌株及质粒见表1。 1.2 takara公司 本研究所用的限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ及Taq酶均为TaKaRa公司产品;氨苄青霉素、红霉素、卡那霉素均购自Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯;引物合成由南京金斯特公司完成,所用引物参见表2;基因测序由南京金斯特公司完成。 1.3 干草芽菌o15菌突变体数据库的构建 1.3.1 细胞培养、转化 枯草芽孢杆菌OKB105感受态细胞的制备参照Spizizen的方法,菌株感受态细胞制备过程中所需的SPⅠ培养基和SPⅡ培养基配方见文献。每500 μL感受态细胞中加入15 μL pMarA质粒(1 μg),轻轻混匀,30 ℃ 100 r·min-1振荡培养30 min。此后,加入600 μL含5 μg·μL-1红霉素的LB液体培养基,30 ℃ 200 r·min-1继续振荡培养1.5 h;取转化后的培养物100 μL涂布于含10 μg·μL-1红霉素的LB平板,30 ℃静置24 h;挑取转化子,计数转化子数并计算转化效率。转化试验重复3次,每次设3个重复。 1.3.2 转化子ohb105-ma扩增 将转化子接种于含5 μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中,30 ℃培养12 h,采用Invitrogen公司的质粒提取试剂盒提取转化子质粒。用KpnⅠ对1 μg转化子OKB105-MA的质粒进行单酶切验证,20 μL反应体系,具体步骤参照Spizizen的方法。参照文献的方法,用引物oAtnpFwd和oAtnpRev扩增转化子OKB105-MA质粒的Himar1转座酶编码基因片段。扩增程序:96 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s,62 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30 个循环;72 ℃ 10 min。 1.3.3 菌株的培养条件 将转化子OKB105-MA接种于含10 μg·μL-1红霉素的LB液体培养基中,30 ℃ 200 r·min-1振荡培养18 h;取菌液150 μL转接于含10 μg·μL-1红霉素的25 mL LB液体培养基中,30 ℃ 200 r·min-1振荡培养12 h;将菌液稀释105～106倍,取200 μL涂布于含5 μg·μL-1卡那霉素的LB平板,50 ℃高温培养12～16 h;随机挑取单菌落2 000个,构建突变体文库。 1.4 扩增程序及扩增方向 从突变体文库中随机挑选15个突变体,参照Liu等的方法提取突变体基因组。参照文献的方法,采用引物oITR扩