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bac-o-bac策略在昆虫杆状病毒表达系统中的应用 自20世纪80年代初以来，建立了完整的病毒表达系统（bevs），成为目前丙烯酸酶的四种表达系统之一。该系统具有表达效率高,表达产物与天然产物类似的优点,但系统本身也存在着筛选带有外源基因的重组病毒效率较低(仅0.1 %~1 %)、产物较难纯化等问题。为此,研究者们展开了各种尝试,包括杆状病毒基因组的线性化、应用酵母系统操作杆状病毒基因组、应用体外酶促反应操作杆状病毒基因组、利用细菌转座子操作杆状病毒基因组(即Bac-to-Bac策略)等。其中,Bac-to-Bac系统是目前获取重组杆状病毒最为方便、快捷和有效的途径。 1 重组病毒基因组 1993年,Luckow等根据F因子载体原理,用类似于酵母体内重组的方法构建了一种新型杆状病毒穿梭载体,取baculovirus和plasmid的字头字尾命名为bacmid,意为杆状病毒质粒,其意义在于突破了多年来必须在活细胞内重组病毒基因组的束缚。由于从细菌(bacteria)到杆状病毒(baculovirus)的全部操作都在细菌中进行,所以这一系统又称Bac-to-Bac策略。Bac-to-Bac系统与传统的杆状病毒载体系统(BEVS)相比,至少有两大优点:一是大大缩短了重组病毒构建所需的时间,传统方法即便是技术熟练的人员也需6~9周甚至更长的时间,而应用Bac-to-Bac策略用7~9 d就可以获得所需的重组杆状病毒;二是由于重组病毒DNA在细菌内产生,可根据菌斑颜色筛选(蓝白筛选),不存在野生型和非重组型病毒交叉污染的问题,因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒,而且转座率高,纯化率达100%。 2 to-bac系统的发展 2.1 bac-to-bac重组病毒的表达系统 Bac-to-Bac系统自1993年建立以来,正由于它与传统的BEVS比较有如此大的优点,因而引起了世界各国学者的关注,并掀起了昆虫杆状病毒表达系统表达外源基因的高潮。1994年Ayres等成功地测序出苜蓿银纹夜蛾杆状态病毒(Autographa californicamultiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)全部序列,随后家蚕杆状病毒(Bombyx morinuclear polyhedrosis virus,BmNPV)基因序列也面世了,这些成就极大地推动了Bac-to-Bac系统的研究和发展。20世纪90年代中期,利用昆虫细胞表达系统表达动物病毒的结构蛋白基因,在昆虫细胞 (如Sf 9) 中装配出病毒样颗粒的工作就已有成功的例子。90年代末,杆状病毒载体的构建和表达已经达到很高的水平。 Bac-to-Bac表达系统经过多年的发展,已分化出面向AcMNPV、BmNPV和棉铃虫杆状病毒(Helicoverpa armigeranuclear polyhedrosis virus,HaNPV)的3个子系统。AcMNPV的Bac-to-Bac系统发展最早,研究也最深入,对其他两个系统的发展影响很大。近年来,Invitrogen公司应用Bac-to-Bac策略已开发出面向AcMNPV的表达系统。该系统中,Bacmid包含有mini-F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn7的靶位点(mini-attTn7)以及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA 片段。Bacmid 既能像质粒一样在E.coli中复制,又能像病毒一样感染昆虫细胞,供体质粒pFastBac含有庆大霉素抗性基因(Gen+)及Tn7的左右两臂序列,两臂序列之间是多角体蛋白的启动子,下游依次是多克隆位点、SV40的PolyA位点。将含有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞(该细胞含有杆状病毒穿梭载体、Kanr和复制子以及LacZ肽段编码基因),供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座插入到杆状病毒基因组中,破坏了LacZ的表达。通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal 的培养板筛选,重组的Bacmid(即重组病毒基因组) 转化体菌落呈白色,而非重组Bacmid 转化菌落为蓝色。从白色菌落培养物提取Bacmid DNA ,用脂质介导法转染昆虫细胞即可获得重组病毒。 2.2 att载体的功能 Invitrogen 公司为重组蛋白的表达构建了以下6个高效的载体。pFastBacTM1:以多角体启动子启动,含有一个多克隆位点。pFastBacTMHT:以多角体启动子启动,N端有6个组氨酸为标记,可以通过一个TEV的作用去掉6个组氨酸。pFastBacTMDual:主要运用于1个载体表达2个目的蛋白,它含有2个高效启动子——多角体启动子和P10启动子;pDESTTM8、pDESTTM10和pDESTTM20:主要是为快速克隆设计的Ba