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-环糊精葡萄糖基转移酶-cgase突变体的制备 葡萄糖原旋转酶（csi2.4.1.19）是京粉酶家族的重要成员。它的独特功能是将淀粉转化为环糊精。环糊精是由6个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列,其中最常用的是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精,它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。环糊精分子的内表面呈疏水性,外表面呈亲水性,这种独特的分子结构使它可以通过范德华力、疏水作用力等与一些疏水性客体分子或基团形成包合物,从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等,因此其在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。3种常用的环糊精中,由于β-环糊精溶解度最小,可以很方便地通过分步结晶的方法制得,因此,目前工业生产中大量制备和广泛应用的是β-环糊精,但是β-环糊精无法取代α-环糊精的用途,相比于β-环糊精,α-环糊精具有更小的空腔,更适于包合具有低分子质量的分子,并且是一种非常好的膳食纤维,在食品等领域已显示出无可比拟的优势。虽然市场上对α-环糊精有较大的需求,但由于CGTase的产物特异性差,而且α-环糊精的水溶性相对较高,不容易分离纯化,因此造成生产成本高,α-环糊精价格昂贵。国外虽然已有相关研究报道,但是产量非常有限,国内尚未见α-环糊精生产工艺的报道,因此研究α-环糊精的酶转化与制备工艺显得至关重要。 生产α-环糊精的方法主要有化学法和生物法,化学法是将马赛兰氏淀粉与四氯乙烷反应,生成α-环糊精粗品,再经过滤和水蒸气蒸馏后得到纯度相对较高的α-环糊精。由于α-环糊精溶解度较大,所以化学法制备比较困难,而且会对环境造成较大污染。生物法目前被认为是极具应用潜力的方法。然而关于生物法生产α-环糊精的报道则很少。陈龙然等从土壤中分离出一株地衣芽孢杆菌,该菌发酵得到的CGTase作用于淀粉后,产物以α-环糊精为主,β-环糊精次之,二者比例为2.47:1,环糊精总产率为29.8%。王俊英等从其实验室保存的一株Bacillus sp.60221细菌中纯化了一种α-CGTase,利用该酶转化淀粉24h,总转化率可达4 1%,其中α-环糊精占总转化产物的7 8%。 目前,所有已知的野生型CGTase生产的均是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的混合物,这给产物的分离纯化带来很大不便,因此如何提高环糊精生产的特异性成为了近几年研究的热点。研究表明,通过一些定点突变的设计,对CGTase活性中心底物结合凹槽附近的一个或多个重要的氨基酸残基进行取代、插入或者删除等会改变CGTa se产物中α、β、γ构型的比例,从而改善环糊精的产品特异性,并减弱产物抑制。 根据文献报道,CGTase的一级结构是决定产物特异性的主要内在因素,CGTase活性中心凹槽至少包括9个糖结合位点,在环化过程中,葡萄糖残基在亚位点-3上的结合模式发生改变,最近的一些定点突变结果证实了与定位在亚位点-3上的葡萄糖残基有相互作用的氨基酸残基对CGTase的产物特异性具有重要的作用。氨基酸残基89(按照Peanibacillus macerans CGTase编号)是亚位点-3的组成部分,因此在前期研究中,本实验室选择Peanibacillus macerans JFB05-01 CGTase中的Tyr89作为定点突变的目标,将Peanibacillus macerans JFB05-01 CGTase中位于亚位点-3处89位的酪氨酸(Y)突变成天冬氨酸(D),发现该突变体可以显著提高α-环糊精特异性。本实验对α-CGTase突变体Y89D制备α-环糊精的影响因素进行初步研究,从而为α-环糊精的工业化生产提供参考。 1 材料和方法 1.1 马铃薯淀粉t-y29d/pet-20b/n.colib21de3 大肠杆菌cgt/p ET-20b(+)/E.coli BL21(DE3)由本实验室构建并保存;大肠杆菌cgt-Y89D/p ET-20b(+)/E.coli BL21(DE3)由本实验室构建并保存。 α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精Sigma-Aldrich(上海)公司;玉米淀粉诸城兴贸玉米开发有限公司;马铃薯淀粉宁夏固原六盘山淀粉公司;木薯淀粉广西武鸣淀粉厂;乙腈(色谱纯)美国Honeywell公司;其他试剂均为国产分析纯。 1.2 高速离心cf130 7200型分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司;PYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂;冷冻立式离心机CF16RX日本Hitachi公司;高速离心机德国Eppendorf公司;W201D电热恒温水浴摇床江苏金坛国华仪器厂;Waters 600HPLC色谱仪、Waters自动进样器、Waters 2410示差检测器美国Waters公司;色谱柱Li