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苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的基因表达调控作用 史密斯等人成功地重组了水稻银杏叶变换率的多角形病毒（acpmv），并在草坪贪婪的夜生动物细胞系统（sm-9）中显示了人类的-干预。随后Maeda等用Bm NPV为载体，在家蚕幼虫体内高水平的表达了人的α-干扰素。目前，杆状病毒表达载体系统（Bculovrirus expression vector system,BEVS）已得到了广泛应用，被公认为当今基因工程四大表达系统之一（另3种是细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）。 1 在细胞外源基因表达方面的应用和完善 Ac NPV是应用最为广泛的杆状病毒表达载体，它是环形双链DNA病毒，含有的碱基对数目为1.3×105bp。具有感染性的病毒进入易感昆虫细胞，感染后期在细胞核内形成的多角体蛋白的启动子具有极强的启动蛋白表达能力，常被用来构建杆状病毒表达载体。 目前，用BEVS表达的外源基因已达500种以上，并在基因工程生产蛋白质的研究方面存在巨大潜力。但由于传统BEVS采用转移载体与野生型病毒共转染昆虫细胞，其重组率较低，并需经多轮空斑纯化才能获得重组病毒，这对于利用该系统研究基因结构与功能、表达与调控作用很不方便。近年来，又发展了一些重组病毒筛选的新技术，现将这些新技术作一简单阐述。 1.1 ．线型化病毒的诱导拯救 Kittes等将一个限制性酶切位点引入野生型Ac NPV多角体蛋白基因内，用限制性内切酶消化野生型病毒DNA，这种线型化的病毒DNA不能在胞内复制出成熟的病毒颗粒，因此，不能感染昆虫细胞，通过同源重组拯救为环状的复制型，才能复活而在昆虫细胞中复制。当它与转移载体共转染昆虫细胞时，如果不发生同源重组就无野生型病毒背景出现，故该系统同源重组率在理论上可达100%。 1.2 使用击穿载体的检测 美国Gibcobrl公司开发的Bac to Bac杆状病毒表达系统是利用转座原理在大肠杆菌内构建而成的。Pfast Bac是供体质粒，带有庆大霉素抗性基因(Gen+)。用克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，该细胞含有杆状病毒穿梭载体和复制子以及来源于PUC质粒的Lac Z肽段编码基因。供体质粒中的外源基因在转座酶作用下，干扰Lac Z的表达，所以含有重组质粒(Bacmid)的DH10Bac细菌在有IPTG、X-gal的培养板上形成白色菌落。从菌落培养物提取重组质粒DNA，用脂质介导法转染昆虫细胞即可获得重组病毒。该系统缩短了实验的时间，重组病毒筛选也在大肠杆菌中进行，利用抗性基因筛选和PCR鉴定简化了实验程序。南开大学耿朝晖等利用这个穿梭载体系统表达了人的生长激素（human growth hormone,hGH），用免疫化学发光法测得转染上清中hGH表达水平可达18 mg·L-1，是用传统BEVS方法表达的400倍。中山大学庞义建立了甜菜夜蛾核多角体病毒Bac to Bac外源基因表达系统。 1.3 在酵母中的应用 杆状病毒只要含有酵母的自我复制序列（autonomous replication sepuence,ARS）和着丝粒（centromere,CEN），就可以在酵母中扩增。Patel等构建了含有ARS和CEN的Ac NPV，为了便于在酵母中筛选重组病毒，还在病毒DNA中插入URA3和SUP4-0两个基因，作为选择标记。转移载体含有外源基因，其两端侧翼分别是杆状病毒序列和酵母ARS序列。缺乏SUP4-0基因的重组穿梭载体能生长在合适的酵母菌株上，这样能有效地分离重组穿梭载体。该方法虽然省去了传统筛选噬斑的繁琐，但该载体的转染效率不高，并且增加了用蔗糖梯度纯化重组载体的工作量。 1.4 重组病毒的筛选 单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV1）的tk基因产物胸苷激酶（SHV1-tk），能催化核苷酸类似物，将核苷酸类似物转变为有毒的中间体，从而抑制病毒DNA的复制。Godeau等利用tk基因的上述特征，开发出一种新的重组病毒筛选方法。研究表明，HSV1-tk基因对于阴性杆状病毒的筛选是一个很好的标记，Ac NPV介导的HSV1-tk的表达导致了病毒复制对核苷酸类似物的敏感性，当药物敏感性通过外源基因置换而丧失时，病毒复制重新恢复，因而可以选择性扩增tk———重组体。郑州大学李杰等将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因亚克隆于真核表达载体pc DNA3上，成功构建了含该基因的真核表达载体（pcDNA3-tk）并转染食管癌细胞，经RT-PCR检测确定含HSV-tk基因的真核表达载体能在食管癌细胞中表达。 1.5 ．7重组病毒的分离和纯化 P1噬菌体编码Cre重组酶，是交换体P1的基因座（locus of crossover P1,lox P1）位点。Stricklett等将lox P序列分别引入Ac NPV（获v Aloz）和转移