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中药守宫多糖体外抗肿瘤免疫的研究进展 保护宫殿是虎科动物无角刺科动物的特征。它可以去除器官疾病的所有。这是一种传统的冷、热、硬、中药，具有驱风、定痛、益气、解毒的功效。长久以来, 守宫被用于治疗瘰疬癌肿, 是一味重要的抗癌动物药。国内诸多医家使用守宫治疗恶性肿瘤取得了很好的疗效。研究表明:鲜壁虎冻干粉可以抑制 H22小鼠肿瘤生长, 诱导肿瘤细胞凋亡及血管生成。 传统中医认为守宫咸寒有小毒。药学研究发现守宫含有马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质、脂肪油、多种氨基酸、微量元素、维生素等。但这些成分的发现不足以系统阐明守宫的抗肿瘤机制及具体作用靶点, 而守宫的毒性作用又限制了其临床大剂量应用, 故守宫的日用量一般仅 1.5～4.5 g。国内外至今未能从守宫里分离出其抗肿瘤、抗病毒与免疫调节的有效成分。大量研究表明多糖物质对正常的人体细胞无毒。经过前期大量研究, 笔者从守宫中分离得到硫酸守宫多糖, 发现该成分可以抑制肝癌细胞 BEL-7402 的增殖并诱导分化, 而对正常肝细胞 L-02 的生长发育几乎没有影响, 起到了很好的增效减毒作用。本实验进一步研究守宫多糖体外对淋巴细胞增殖及细胞毒作用的影响, 为探讨守宫抗肿瘤作用物质基础提供依据。大量研究表明, 多糖具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。多糖可以活化巨噬细胞, 促进淋巴细胞有丝分裂, 增强 NK 细胞与 LAK 细胞活性, 增强 TD细胞功能, 诱生 IL-2、IL-12、TNF 等细胞因子。目前国内外从天然原料药里分离得到的绝大多数为植物多糖和微生物多糖。笔者从中药守宫中分离得到守宫多糖 (gecko polysaccharide) , 本研究将进一步探讨守宫多糖体外淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响。 1 pbmc的诱导、增殖和活化 1.1 主要试剂与药品:守宫多糖 (质量分数95%) 由天津市肿瘤医院中西医结合科副主任医师吴雄志博士提供 (其分离制备工艺已申请国家专利, 专利号:CN1676533A)。肝癌 BEL-7402 细胞由天津市肿瘤医院中心实验室提供。RPMI-1640 培养液购自北京天润普达生物科技有限责任公司。PBS 磷酸盐缓冲液购自北京中山金桥生物技术有限公司。CO2恒温培养箱 (Thermo HEPA class 100) 。 1.2 肝癌细胞冻融液的制备:以肝癌 BEL-7402 细胞冻融液为肿瘤抗原。取 BEL-7402 细胞 2×106/mL (以 PBS 液调整细胞数) , 经 -70 ℃ (30 min) 、37 ℃ (5～10 min) 反复冻融 3次, 镜检无细胞, 冻融液培养无细胞生长, 即得 BEL-7402 肿瘤相关抗原, 保存于 -20 ℃ 备用。 1.3 密度梯度法分离外周血单核细胞 (PBMC) :抽取健康人外周血 20 mL, 立即注入经肝素抗凝试管, 加 PBS 20 mL 稀释, 缓慢加入到有淋巴细胞分离液 40 mL 的离心管中, 2 000 r/min 离心 20 min, 轻轻吸出中间白色层细胞, PBS 洗涤2次, 即为较纯的 PBMC。PBMC 于含 5% CO2的 37 ℃ 恒温培养箱中培养, 培养基为含 10% 灭活小牛血清的 RPMI-1640 (Gibco 公司) , 含 1% 双抗 (青霉素和链霉素) 。 1.4 淋巴细胞增殖试验:将 PBMC 以 2×106/mL 密度分6组 (每组6孔) 接种于 96 孔板中。前3组在接种 3 h 后, 分别加入守宫多糖 100、10 μg/mL 与等体积 PBS。后3组在接种后 3 h 吸取未贴壁细胞, 移入另外18个空白孔中, 然后每组分别加入守宫多糖 100、10 μg/mL 与等体积 PBS。细胞共培养 4 d, 培养结束前 4 h 将前3组每孔轻轻吸出 100 μL 培养液后, 吸取未贴壁细胞及上清, 移入另外 18 个空白孔中。后3组每孔轻轻吸出 100 μL 培养液后, 所有6组细胞每组分别加入 MTT (5 mg/mL) 10 μL, 放入培养箱中继续培养 4 h 后, 1 200 r/min 离心 10 min, 去上清, 加入 DMSO 100 μL, 用酶标仪测 490 nm 处吸光度 (A) 值表示淋巴细胞增殖水平。 1.5 PBMC 的活化:用 RPMI-1640 完全培养基调整 PBMC 为 2×106/mL, 加入6孔板中培养, 6 h 后分别加守宫多糖与肝癌细胞冻融液:①只加肝癌细胞冻融液 (终浓度为1×104/mL) ;②加肝癌细胞冻融液与守宫多糖 100 μg/mL;③加肝癌细胞冻融液与守宫多糖 10 μg/mL。各组加入肝癌细胞冻融液的肝癌细胞终浓度为 1×105/mL。 1.6 BEL-7402 细胞培养:将 BEL-7402 细胞以