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提取细胞RNA的步骤 提取细胞RNA的步骤 PAGE/NUMPAGES 提取细胞RNA的步骤 提取细胞RNA的步骤： 六孔板每孔细胞中加入1mlTrizol，冰上搁置5min，枪头吹打。 将各孔裂解液吸到1.5mlEP管中，加入氯仿0.2ml/管，使劲振摇15s。15－30℃下孵育2-3min， 离心（4℃，12，000g，15min）。 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和基层红色为蛋白质）， 当心汲取上层无色液体移入一新的 EP管中。 4) 加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育 10－30min，离心（4℃，12，000g， 10min）。此中假如加入等体积异丙醇后，置于试管架上用 PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉 淀30min成效更好。 5) 去上清，积淀加入75％乙醇1ml，旋涡振荡 30s，离心（4℃，7，500g，5min）。 6) 当心去上清，管内积淀在超净台中鼓风静置干燥 3-5min。最好是用枪头汲取上清， 尽量除掉。 加入20ulDEPC水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。 8)细胞总  RNA  的判定：  ％琼脂糖电泳判定细胞总  RNA，察看出现条带及各条带亮度。 紫外分光光度计测定：  分别测定细胞总  RNA  在  260nm  和280nm  处的光密度值  (OD),并计算  RNA 的含量和纯度。 1、实验目的 提取人体细胞的总RNA和mRNA。 2、本实验所需试剂 1）、CNE-2细胞及培育细胞的一系列条件， 2）、PBS缓冲液，TRIZOL试剂， 3）、DEPC办理过的水、大、中、小Tip及1.5mlEP管, 4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇， 5）、mRNA分别试剂盒：OligotexmRNAMiniKit,Cat.no.:70022,QIAGEN。 6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。 3、实验流程 3.1细胞总RNA的提取 1）、6孔板细胞（CNE-2）集合度为90-100%时，拿出无菌室，去其上清，用PBS洗两次 后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco企业）1ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（察看：液体 变黏稠，细胞脱壁）。 2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC办理过的1.5mlEP管中，加新开的氯仿 0.2ml，轻摇  15秒。 3）、室温静置2-3分钟后，12000rpm，15min，4℃，离心。而后取上清无色水相（约 到EP管（DEPC办理过），加0.5ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。  0.6ml） 4）、12000rpm，10  分钟，  4℃，离心。察看总  RNA  在管底的白色积淀，弃去上清（当心 别丢了积淀），  75%乙醇  1.0ml  清洗（用  DEPC  水新配制）后，  7500rpm，5min，4℃离心。 5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干积淀5-10分钟，DEPC办理水20-30ul加入，中枪打匀，55-60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。 6）、电泳。 3.2从总RNA中分别mRNA（OligotexmRNAMiniKit,Cat.no.:70022,QIAGEN） 1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25mg）到一个新的无RNase的EP管中，用无 RNase的水定容到250ul。 2）、加入BufferOBB250ul,OligotexSuspension15ul。用Tip打匀或用手弹匀。 3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级构造）。 4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA联合）。 5）、高速离心2分钟，当心吸走上清（该上清要保存），留下约 50ul的上清在原管里。 6）、用BufferOW2400ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的积淀，而后将这些加到套有 1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心 1分钟。 7）、将SPIN柱子移到一个新的 EP管上，加BufferOW2400ul 到柱子，高速离心 1分钟， 扔掉滤过液。 8）、将SPIN柱子移到一个新的 EP管上，加20-100ul热的（70℃）BufferOEB到柱子上， 用Tip往返吸打3-4 次，高速离心 1分钟。 9）、为保证最大的 mRNA产量，可再次重复第8步。 10）、电泳。 4、mRNA的应用： RT-PCR,Northern杂交，cDNA文库建立,mRNA尾端迅速扩增(RACE)，差别表达 (DDRT-PCR)，引物延长反响(PrimerExtension)，体外转录(InVitroRNATranscription),RNA 标志(RNAlabelin