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血小板血型检测方法的研究进展 血小板增多的抗高血压药物在临床医学和输血实践中起着重要作用。目前，血液清血法可用于检测血小板计数、免疫放射免疫、酶联免疫、混合凝集等。近年来，随着免疫、生物学的发展和流式细胞仪的应用，检测方法也取得了突破。例如，抗血小板聚集授力于血小板表面的授力试验、磁珠诱导血小板分析、革兰氏合金管技术等。但大多数方法在实用性、敏感性和特异性及操作仪器等方面存在问题, 不能在一般实验室和血库推广;只有固相微板技术因其操作简便、不需特殊仪器而被广泛使用。固相微板技术于1985年由Rachel JM报道用于血小板血清学试验, 经过多年的改良, 现国外有成品试剂盒供应;国内1987年由吴国光首先报告固相化血小板血清学试验 , 1993年刘达庄对此法进行改良。笔者总结国内外的方法特点, 结合实验条件, 对血小板包被条件进行了研究筛选, 达到理想的效果。 材料和方法 1 mcp试剂检测细胞的表达 1.1Modified Capture-P IMMUCOR公司生产 (内含:MCP检测微孔, 低离子液, 指示细胞, 强+、弱+、阴性对照血清, 洗涤/贮存液) , 50%戊二醛溶液, PBS溶液, 37℃水浴箱, 离心机 (可离心酶标板) 。 1.2阳性标本使用MCP试剂的强阳性对照, 进行倍比稀释;阴性标本为MCP试剂的阴性对照;特异性测定的30例标本为临床随机输注血小板患者的血清。 2 方法 2.1 血小板分离和制备 从富血小板血浆中分离血小板, 并调整浓度为2 000 个/μl左右。 2.2 血小板阴阳性的测定 将50%戊二醛溶液分别配成不同浓度, 选择不同时间进行血小板包被, 离心洗板后在倒置显微镜下观察血小板单层效果, 进行阴阳性测定, 同时用capture-P试剂盒作对照, 最后确定使用0.75%戊二醛溶液。 2.3 离心微孔条制备 振荡混匀, 37℃孵育30分钟后洗板6次 (注意洗板后不要使微孔凉干) 。各孔立即加入1滴指示细胞。700～900 g离心微孔条1分钟。观察结果。 3 结果观察 阴性:指示细胞全部在微孔底部形成边缘清晰的细胞扣;阳性:指示细胞完全或部分平铺在微孔表面, 或在底部细胞扣周边有扩展的边缘。 包被血小板的检测 比较戊二醛快速包被血小板法和Capture MCP方法, 进行灵敏度、特异性测定, 同时对不同包被批次间进行测定。见表1～3。 讨论 本包被方法测定结果同进口试剂测定结果相吻合, 可以替代进口试剂进行血小板抗体及相容性测定, 国内一般以聚甲醛固定15分钟后进行操作, 而本方法可以立即进行测定, 节省时间。因我院使用ABS2000全自动血库系统进行红细胞相容性检测, 常规备有低离子液、PBS及指示细胞试剂, 解决包被条件后, 可以不用另行购买MCP试剂即可开展血小板抗体及相容性配型测定。该方法结果清晰、稳定。在包被血小板时, 须有足够的血小板, 如包被的血小板量太少, 可影响测定结果, 产生假阳性。另外在操作过程中, 实验所用试剂和用品被细菌或化学物质污染、孵育时间不当、离心不当、洗涤不当等因素也可引起结果不准确。在洗板时最好用pH6.5～7.5 PBS, 如在加入指示细胞前的洗板时未使用PBS, 则可能使抗原抗体结合物受到破坏。包被用的血小板, 用EDTA、ACP、CPD等抗凝, 凝固血标本不能使用。采集富血小板血浆需立即分离, 但采集48小时内血小板包被效果最好。