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血清中有纤维蛋白和红细胞对酶联免疫吸附试验测定的影响 酶联免疫吸附试验（elisa）对测量的一般随机因素有严重影响。它排除了一些困难和较少的报告。本研究以乙肝有面抗原 (HBsAg) -ELISA进行干扰性因素探讨, 然后将其排除简易化、文件化、方便基层医院、社区应用, 进行乙肝病毒抗原体普查, 为预防乙肝服务, 对其他酶联免疫检测也起借鉴作用。 1 数据和方法 1.1 女性主要年龄分布 正常对照组:随机采用集体体格检查正常, HBsAg (-) , 心、肺、肝、肾、止凝血无异常及无其他合并症者100例, 其中男性50例, 女性50例, 年龄15～60岁。研究组:随机采集我院2004年1月至2005年9月院校进行健康查体已确诊HBsAg (-) 、HBsAb (+) 的志愿者600例, 其中男性410例, 女性190例, 年龄 (19±2) 岁, 心、肺、肝、肾、止凝血功能正常。临床试验组:随机抽样HBsAg (-) 病人200例, 其中肾透析100例, 术后口服抗凝剂病人100例, 年龄14～62岁, 疑有凝血功能障碍。 1.2 真空有机溶血管混血分离 ①正常对照组用一次性无菌注射器抽静脉血3 ml, 注入一次性塑料管内, 置室温6 min, 按离心孵育循环法分离无纤维蛋白血清。②研究组用广州阳普医药疗用品公司生产真空肝素抗凝管、分离胶促凝管、无分离胶促凝管, 各采静脉血3 ml, 置室温6 min, 抗凝管以3 000 r/min离心5 min, 分离血浆;分离胶管以5 000 r/min离心6 min, 分离血清;无分离胶管以5 000 r/min离心6 min后, 用加样器头轻混血块得混红细胞血清。③临床试验组采静血3ml于上述真空分离胶管, 置室温6 min, 以5 000 r/min离心6 min, 分离血清。 1.3 选择合适的树种 酶标仪、洗板机为芬兰生产, 型号分别为Multiskan MK3和Well 4MK2;离心机为北京离心机厂生产的LG-2.4型;HBsAg-ELISA试剂盒由珠海亚利生物工程公司提供。 1.4 方法 1.4.1 酶标仪读板检测 将HBsAg-ELISA试剂盒放置室温下平衡1 h, 双蒸水稀释洗液, 测定孔设空白、阴性、阳性孔各两个, 正常对照组血清与研究组的血浆、混红细胞血清、分离胶分离血清及临床试验组分离的血清进行配对检测, 空白孔加洗液50 μl, 检测孔加阴性、阳性血清及指定样本50 μl, 除空白孔外, 所有孔加酶标记物液50μl (或1滴) , 混匀, 置37℃恒温箱温育30 min, 然后洗板机洗板5次 (每次浸泡时间30 s) , 反应板拍干, 每孔加A、B底物液各1滴, 混匀, 置37℃温育15 min, 每孔加终止液50 μl或1滴2M H2SO4, 即进行酶标仪读板。 1.4.2 加底物、加终止、读板法 试剂平衡、洗液稀释、加样、加酶标液、温育温度时间、加底物、加终止、读板都同常规法, 所不同的是洗板。洗板时先甩去混合液, 用双蒸水快速洗板二次, 拍干, 然后洗板机洗板3次 (每次浸泡时间同上) 。 1.4.3 统计方法 计量资料以均数±标准差 (xˉxˉ±s) 表示, 组间资料比较采用t检验, 组内资料比较采用因素配伍组方差分析。 2 两组分离胶血清的情况比较 研究组血浆、红细胞血清及临床试验组血清的常规法检测HBsAg的S/CO值与正常对照比较, 统计学分析存在差异 (P0.05) , 而研究组分离胶血清则无差异 (P0.05) ;研究组血浆、红细胞血清及临床试验组血清的改良法检测HBsAg的S/CO值与正常对照比较, 统计学分析无差异 (P0.05) , 见表1。 3 红细胞干扰活性项目 ELISA以其灵敏度高, 特异性强, 操作简单, 消耗费用低, 无需特殊仪器设备等优点, 被研究单位、大中医院、基层医院、社区广泛应用于传染病、肿瘤等病的诊断, 由于其灵敏度高, 存在较多干扰测定的因素, 给基层医院、社区应用该项技术带来障碍。结果不准确, 对诊断、治疗、预防会带来负面影响。纤维蛋白、红细胞是干扰酶联免疫吸附试验常见的随机因素, 前者随血清加入聚苯乙烯微量反应孔后, 易粘在反应孔壁, 常规法洗板难洗干净, 加底物A、B后, 引起非特异性显色;血清中带有红细胞、血块释放大量类过氧化酶活性的血红蛋白, 同样引起非特异显色, 使结果出现假阳性。ELISA常规法检测研究组血浆、带红细胞血清、临床试验组血清与正常对照组血清的HBsAg-ELISA的S/CO值, 经统计学分析存在差异 (P0.05) , 说明纤维蛋白、红细胞对测定有影响。 纤维蛋白及红细胞干扰酶联免疫测定简易排除方法。测定前 (分离无纤维蛋白、红细胞血清) , 可采用离心孵育循环法或分离胶促凝管法分离