宁夏炭疽芽胞杆菌毒力鉴定及基因分型研究.docxVIP

? ? -宁夏炭疽芽胞杆菌毒力鉴定及基因分型研究 ? ? 杨 聪，高建炜，马江涛，海 娥，邹 悦，陈丽莉，李小璐，韩 坤，张术斌 炭疽是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人兽共患传染病。主要传染源为牛、羊、马等食草动物，人因接触患病动物而被感染[1]。宁夏是炭疽自然疫源地，自2014年以来疫情呈现上升趋势，且疫源地面积较广，防控难度逐渐增大[2]。有研究发现炭疽芽胞杆菌的致病力与其毒力因子有关，当菌体中具有毒力因子即可判定为强毒菌株[3]。由于炭疽芽胞杆菌遗传进化相对保守，导致其基因缺乏遗传多样性，目前常用的基因分型技术主要有可变数目串联重复序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)和单核苷酸多态性(canonical single nucleotide polymorphism, canSNP)两种，对揭示菌株的遗传进化特征具有重要意义[4]。为了解宁夏炭疽芽胞杆菌的致病力和基因分型特征，揭示菌株间的遗传特征及基因型别，本研究对2019-2020年宁夏各地区分离到的炭疽芽胞杆菌进行了相关试验研究，以期为疫情溯源提供线索和科学依据。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 本研究所用菌株为2019-2020年本实验室收集保存的临床分离菌株，共分离到4株炭疽芽胞杆菌，全部分离自患者皮肤渗出液(表1)。 表1 2019-2020年宁夏临床分离炭疽芽胞杆菌菌株信息Tab.1 Background information on strains of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020 1.2 试验材料 Tag DNA聚合酶、无菌水、DNA Marker2000购自全式金生物有限公司；核酸提取试剂盒(QIAGEN DNA Mini Kit)购自德国QIAGEN公司；血琼脂平板、营养琼脂购自青岛海博生物有限公司。MLVA-15各位点引物由上海生工生物公司合成；SNP探针及引物由中国疾控中心传染病所提供；ABI7500Fast荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。 1.3 方 法 1.3.1 菌株基因组DNA的提取 按照QIAGEN试剂盒步骤提取。 1.3.2 毒力鉴定 采用文献报道的4个毒力因子位点[5]设计引物(表2)。反应体系为25 μL：含Tag DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，无菌水7.5 μL。扩增参数为：95 ℃预变性5 min； 95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min， 30个循环；72 ℃延伸5 min。 表2 毒力因子引物序列信息Tab.2 Information on primer sequences for virulence genes 1.3.3 MLVA-15分型 将分离到的菌株提取核酸后，采用Reference[6]报道的引物序列和PCR方法扩增菌株的15个可变重复序列(VNTR)位点。PCR扩增反应体系为20 μL：含Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无菌水6 μL。扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，34个循环；72 ℃延伸5 min。其中vrrB1、vrrB2位点退火温度为55 ℃，VNTR12、VNTR16、VNTR 17、VNTR 35位点退火温度为52 ℃，其余反应条件均相同。将扩增为阳性的样品送往上海生工生物公司进行测序。 1.3.4 canSNP分型 根据文献[6]报道的炭疽芽胞杆菌的13个SNP位点，使用TaqMan探针法对菌株的核酸进行检测。建立20 μL扩增体系，包含：Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物及探针各0.4 μL，DNA模板1 μL，无菌水7.4 μL。扩增条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45个循环；40 ℃ 30 s。使用荧光定量PCR仪7500FAST进行扩增。根据所检测到的荧光信号，对照探针序列，确定所检测的SNP位点是哪一种核苷酸。 2 结 果 2.1 炭疽芽胞杆菌毒力鉴定情况 通过对分离到的4株炭疽芽胞杆菌基因组DNA经普通PCR扩增，结果显示在900 bp、923 bp、373 bp和1 242 bp处分别出现目标条带(图1)，由此可判定这4株炭疽芽胞杆菌均为强毒菌株。 A：扩增Lef基因；B：扩增Pag基因；C：扩增Cap基因；D：扩增Cya基因注：M为2 kb DNA Marker；5、11、17、23为阴性对照；6、12、18、24为阳性对照；其余胶孔为检测样本。图1 2019-2020年炭疽芽胞杆菌毒力基因PCR产物电泳图F