山西白羊草种质资源遗传多样性的ISSR分析.docxVIP

? ? 山西白羊草种质资源遗传多样性的ISSR分析 ? ? 李钰莹，董宽虎 (山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801) 白羊草(Bothriochloa ischaemum)是禾本科孔颖草属丛生、具匍匐茎的多年生暖季型牧草，属C4植物，具有高产、抗旱、耐牧等特点，是我国暖性草丛类草地的建群种，主要分布于我国暖温带森林草原区和落叶阔叶林区。白羊草草地是山西中南部地区低山丘陵区的主要草地类型［1］。国外早在20世纪50年代对于白羊草能进行无融合生殖(apomixis)已有报道［2-3］，即白羊草可以不经过雌雄性细胞的融合而产生有胚的种子;国内肖辅珍和王景林［4］采用石蜡切片法和苏木精浅染整体透明法观察了北京地区的白羊草生殖过程，观察到不定胚、双胚、多胚囊以及双苗现象，证实了白羊草的无融合生殖现象。白羊草可以进行有性繁殖和无融合生殖［2-3，5-6］，而这2种繁殖存在资源的竞争，两者之间的权衡很大程度上受植物生理生化特性和生境条件的影响［7］，对于山西省境内不同地域的白羊草自然状态下的生殖特点还罕有报道。约在20世纪早期白羊草作为牧草引入美国［8］，白羊草现已广泛分布于美国的中部和南部地区，对于白羊草的研究国内外已做了大量的工作，主要集中在生理生态方面［9-12］，利用分子手段对白羊草的研究还罕有报道［13-14］。 简单序列重复区间(inter simple sequence repeat，ISSR)DNA分子标记技术是Zietkiewicz等［15］于1994年提出，在PCR(polymerase chain reaction)中直接使用微卫星序列进行DNA扩增［16］，具有操作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所需DNA模板的量少而倍受青睐。ISSR标记在雀麦(Bromus)［17］、燕麦(Avena sativa)［18］、扁蓿豆(Melissitus)［19］和苜蓿(Medicago)［20］等牧草种质资源的遗传多样性研究领域得到广泛应用。山西省白羊草野生资源丰富，分布广泛，是较为重要的建群种植物之一。本研究利用ISSR分子标记对山西省内33个自然居群白羊草进行了遗传多样性研究，以期从遗传上鉴定这些材料，为后期的育种和种质资源的收集、保存工作奠定基础，同时从分子层面揭示出山西省内不同地域白羊草的繁殖特点。 1 材料与方法 1.1 材料 参试白羊草种质资源于2010年10月采自山西境内，共33个自然居群，各居群地理信息如表1。2011年6月种植于山西农业大学动物科技学院草业科学实验室，待植株正常生长到50 d后采样。对不同居群，随机收集8株以上［21］的白羊草无污染叶片均匀混合后存于－80℃冰箱备用。 1.2 方法 1.2.1 总DNA的提取与检测 采用改良的CTAB法提取基因组DNA［16］，紫外分光光度计检测纯度，核酸分析仪测定DNA浓度。稀释至10 ng/μL，母液于－20℃冰箱中备用［13］。 1.2.2 引物筛选 引物从哥伦比亚大学(University of British Columbia Biotechnology，UBC)提供的96条引物序列中选出25条在禾本科牧草中多态性较高的引物进行筛选，引物由生工生物工程(上海)公司合成，其中23条引物都能扩增出清晰的条带。经过综合考虑其多态性、重复性和稳定性，最终选出10条用于本次试验，引物序列如表2所示。Taq DNA酶、dNTPs、Mg2+和10×PCR Buffer购自宝生物工程(大连)公司。 表1 山西白羊草33个种质资源的地理位置Table 1 Geographic location of 33 B.ischaemum germplasm resources in Shanxi 表2 ISSR分析的引物序列及其扩增结果Table 2 Primer sequence used in ISSR analyses and amplified results 1.2.3 PCR扩增及产物的检测［13］采用Eppendorf梯度PCR仪对白羊草进行ISSR－PCR扩增。扩增程序:94℃预变性5 min，94℃变性45 s，50～60℃(温度随引物不同而定)退火60 s，72℃延伸90 s，共35个循环，72℃后延伸5 min，4℃冰箱保存;反应体系:25 μL 体系中 dNTP 0.2 mmol/L、Taq 酶1.0 U、引物0.6 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、DNA 模板 30 ng、10 × PCR Buffer 2.5 μL。 扩增产物用含有EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，90 V电泳1 h左右，用Bio－Rad GelDoc XR凝胶成像系统观察、拍照保存。 1.3 数据统计与分析 用Quantity One软件选