DB35T 1938-2020饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS 65.120 B 46 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1938—2020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测方法 Duplex real-time PCR assay for Salmonella and Serratia in feeds 2020 - 09 - 29 发布 2020 - 12 - 29 实施 福建省市场监督管理局 发 布 I DB35/T 1938—2020 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 缩略语 1 4 检测原理 1 5 主要仪器 2 6 培养基和试剂 2 7 样品的采集和制备 2 8 操作步骤 2 9 检测过程中防止交叉污染的措施 4 附录 A(规范性附录) 培养液的配制 5 II DB35/T 1938—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国福州海关提出并归口。 本标准起草单位： 福州海关技术中心、海口海关技术中心、福建农林大学动物科学学院、厦门瑞德 利校准检测技术有限公司。 本标准主要起草人：王武军、张体银、吴山楠、阮靖华、郑腾、俞道进、郑晶、白泉阳、王莹莹、 张志灯、于师宇、林杰。 1 DB35/T 1938—2020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法有关的检测原理、主要仪器、培养 基和试剂、样品的采集和制备、操作步骤、检验过程中防止交叉感染的措施。 本标准适用于饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的测定 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Real-time PCR：荧光PCR(Real-time Polymerase Chain Reaction) DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid) Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的荧光阈值时所经历的循环数(Cycle Threshold Value) 4 检测原理 4.1 用非选择性液体培养基预增菌 将饲料样品接种到缓冲蛋白胨水，在36 ℃±1 ℃条件下培养16 h~20 h。 4.2 在选择性培养基上增菌 将4.1中的培养物接种到亚硒酸盐胱氨酸培养基和氯化镁-孔雀绿培养基中，分别于36 ℃±1 ℃、 42 ℃±1 ℃条件下培养24 h。 4.3 提取 DNA 进行实时荧光 PCR 检测和判断 提取4.2中培养物的DNA。采用TaqMan方法， 分别设计针对沙门菌属和居泉沙雷菌的特异性引物和特 异性的荧光探针进行配对。当样品中含有沙门菌或居泉沙雷菌时， 前增菌后提取的细菌DNA通过PCR成指 数扩增，在反应过程中沙门菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被Taq酶水解，把探针上的荧光基团 和淬灭基团分开， 游离的荧光基团信号被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行， PCR产物与荧光信号 的增长呈对应关系。从而通过荧光增量来实时判断沙门菌和居泉沙雷菌的存在与否。 2 DB35/T 1938—2020 5 主要仪器 5.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 5.2 振荡器。 5.3 电子天平：感量 0.1 g。 5.4 无菌锥形瓶：容量 500 mL、250 mL。 5.5 单道可调移液器：容量 0.2 μL~1 mL。 5.6 生物安全柜。 5.7 荧光 PCR 仪。 5.8 冷冻离心机。 5.9 高压灭菌器。 6 培养基和试剂 6.1 水：应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 6.2 缓冲蛋白胨水(BPW)： 配制方法按照附录 A 中的 A.1。 6.3 氯化镁-孔雀绿(RV)增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.2。 6.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC) 增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.3。 6.5 商品化的实时荧光 PCR 预混液。 6.6 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 6.7 沙门菌荧光 PCR 检测用引物(对)和探针序列为： invA-F：5-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3 invA-R：5-GGCTG