山西中部4型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析.docxVIP

? ? 山西中部4型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析 ? ? 刘 璐，王 晨，张 丹，高 宇，程 宇，谭世明，梁立滨，马海利 （山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801） 禽心包积水-包涵体肝炎综合征（Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）是一种主要由4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus-4，FAd V-4）引起的高度传染性和高死亡率的新型家禽疾病[1]。2013年，HPS-IBH开始在我国部分地区流行，2015年在河南、山东、山西、江苏、安徽等省份暴发并传入其他省份[2]。该病多发于4~10周龄的鸡，感病鸡通常无明显症状而突然死亡，死亡率为10%[3]；剖检死鸡可见肝脏肿胀，质地脆弱易破裂，呈点状或斑点状出血，并有土黄色坏死灶，心包积水严重[4]。 禽腺病毒可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，FAdV-4属于禽腺病毒Ⅰ群[5]。Hexon蛋白是禽腺病毒的主要抗原蛋白，具有型、型间、组特异性抗原表位和中和性抗原表位，可与抗体结合，是禽腺病毒的典型结构蛋白[6]，对诊断和预防Ⅰ群禽腺病毒感染有重要意义[7-9]。FAdV-4有2个Fiber蛋白，即Fiber-1和Fiber-2，其中Fiber-2蛋白比Fiber-1蛋白免疫活性更高[10]。Fiber-2蛋白的羧基端头部区域是特异性受体的结合位点，是病毒早期吸附宿主细胞的必需位点，具有抗原性，可用于研制表位疫苗[11]。 目前，关于山西禽腺病毒4型的研究，仅见陆冰洋等[12]对山西省某养鸡场4型禽腺病毒研究。本研究对山西中部地区的太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏进行了FAd V-4的PCR检测，并对阳性样品进行了Hexon蛋白和Fiber-2蛋白全基因序列扩增、测序和分析，用鸡肝癌细胞（LMH）对阳性样品进行了FAd V-4病毒分离，研究病毒对SPF鸡胚和SPF鸡的致病性，旨在为山西省FAd V-4感染防控提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 于2020年采集山西中部地区的太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏组织样品，-20℃保存备用；LMH保存于山西农业大学兽医传染病实验室；TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒购自哈尔滨世纪元亨生物药业有限公司。 1.2 引物设计与合成 根据Gen Bank中发表的Ⅰ群禽腺病毒代表毒株FAdV-4 GC株（登录号：EU177544.1），使用Primer Premier 5.0软件设计用于FAd V-4阳性病料的检测引物和扩增FAd V-4的Hexon、Fiber-2基因全长的引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 表1 引物信息Tab.1 Primer information 1.3 病毒DNA提取 取样品组织，按1∶2比例加PBS匀浆，反复冻融3次，5 000 r/min离心30 min，上清用0.22μm滤器过滤，参照TIANamp Genomic DNA Kit说明书提取样品病毒DNA，-80℃保存备用。 1.4 病料PCR鉴定 以提取的病毒DNA为模板，用FAd V-4的检测引物进行PCR扩增[13]，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，检测目的条带。 1.5 FAdV-4 Hexon和Fiber-2全基因扩增、克隆及测序 以阳性样品的DNA为模板（阴性对照以无菌去离子水代替DNA模板）进行Hexon和Fiber-2全基因序列扩增。取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 1.6 FAdV-4 Hexon与Fiber-2基因序列分析 采用DNAStar Version 7.1软件中的MegAlign程序对测序结果进行比对，并与GenBank中获得的Ⅰ群FAd V的27个血清型参考序列进行同源性比较，用MEGA 7.0软件进行遗传进化分析并且绘制遗传进化树。FAdV-4参考序列如表2所示。 1.7 病毒分离培养 将PCR阳性样品进行处理，取上清液100μL接种LMH细胞，每天观察细胞病变（CPE），待病毒液形成稳定的细胞病变后继续传5代，收集病毒液进行PCR检测[14]。 1.8 病毒的TCID50测定 将生长良好的LMH细胞消化后，加入96孔板中（100μL/孔）。将病毒液进行10倍梯度稀释（10-8~10-1）后接种于96孔板中（100μL/孔），每个稀释梯度8个平行，设正常细胞为对照孔，37℃下置于二氧化碳培养箱中连续观察5~7 d，并记录细胞病变结果[15]，按照Reed-Muench法计算T