黄瓜叶片上感染生物降解菌的两种方法比较.docxVIP

黄瓜叶片上感染生物降解菌的两种方法比较 黄瓜是一种特殊的植物寄生虫菌。它只能寄生和亲水，不能在人工培养基中生长。因此，很少使用石膏发芽法来评估药物对该菌的活性。已有的测定化合物对黄瓜白粉菌生物活性方法有子叶法、叶碟法等,在调查病情时大多目测估计病斑(分生孢子堆)大小分级,统计病情严重度进行评价,容易扩大试验误差。本试验尝试调查白粉病菌分生孢子的萌发率来评价化合物的活性:即采用透明胶带在接种16 h后的黄瓜子叶表面粘下白粉菌分生孢子,置光学显微镜下调查孢子发芽情况,根据不同剂量处理发芽率的高低评价化合物的活性。将该方法与叶碟法进行了比较,以期提供一种新的快速准确测定化合物对黄瓜白粉菌生物活性的方法。 1 材料和方法 1.1 黄瓜品种来源 醚菌酯原药,纯度95%,山东京博集团提供;植物源提取物大黄素甲醚(P3D),纯度为98%,系湖北省农业科学院植保所植物抽提室提纯。 供试黄瓜品种为新泰密刺,购于山东省新泰市祥云种业有限公司。供试黄瓜白粉菌菌株A10、A25、A12、A26、B7、C20、C27和C30,系湖北省农科院植保所植物病理研究室分离保存。 1.2 方法 1.2.1 塑料钵中苏-p6的生长 将新泰密刺种子浸种6 h,催芽后播到直径为10 cm盛丰富腐殖质土壤的塑料钵中,于MGC-300H型人工气候箱中[温度(25 ± 0.5) ℃,相对湿度70%,光照//黑暗=8 h//16 h循环]培养8 d至子叶完全展开待用。用作叶碟法的黄瓜苗在前述条件下培养至5片真叶待用。 1.2.2 /ml苯并咪唑水培养基 将黄瓜子叶离体后摆放在盛15 mL含50 μg/mL苯并咪唑的水琼脂(保鲜培养基),直径为90 mm的玻璃培养皿中。供试菌株摩擦接种在子叶上,于上述人工气候箱中培养8 d至产生足量分生孢子。 1.2.3 标准溶液的稀释 将供试药剂P3D按1 mg原药用100 μL丙酮充分溶解,加20 μL吐温20,在漩涡振荡器上振荡2 min,用0.025%吐温20水溶液稀释至10.0、2.50、0.625、0.156 μg/mL和0.039 μg/mL;按同样方法将醚菌酯配成66.7、7.41、0.823、0.091 μg/mL和0.010 μg/mL。 1.2.4 叶的生长生孢子发育 将12片黄瓜子叶离体后正面朝上摆放在保鲜培养基上,黄瓜白粉菌分生孢子用蒸馏水洗下配成分生孢子含量为1×106个/mL的悬浮液,在微量弥雾塔接种到子叶表面,阴干后盖上皿盖。在25 ℃避光培养16 h;其中6片叶用透明胶带将表面孢子粘下,置光学显微镜下调查发芽情况;另外6片叶采用台盼蓝染色后调查发芽情况,验证胶带粘孢子取样的可靠性。 1.2.5 生培养周期 在微量弥雾塔用各浓度梯度药剂处理子叶和叶碟表面,每浓度梯度3片子叶,20片叶碟,阴干后接种白粉菌分生孢子,孢子萌发法的接种孢子量为1×106个/mL,叶碟法的为1×104个/mL,阴干后盖上皿盖,置人工气候箱中培养。将调查的发芽率转化成抑制率,计算EC50;叶碟法调查时计数叶碟上病菌孢子堆数量,与对照比较转化成抑制率,计算EC50。比较这两种方法测定药剂醚菌酯和P3D对8个菌株的活性结果。 2 结果与分析 2.1 黄瓜养殖黄瓜粉菌芽孢发芽率的测定 每片叶调查8个低倍视野(调查孢子总数大于200个),计算出的发芽率见表1。采用透明胶带取样的白粉菌孢子发芽率为(83.6 ± 3.7)%,采用Trypan blue染色后直接调查发芽率为(85.0 ± 1.3)%,t测验(p=0.39)显示两种取样方法的发芽率一致,表明用透明胶带粘孢子取样的发芽率能代表黄瓜白粉病菌孢子在叶片上的实际发芽率。 2.2 通过真菌萌发法和叶球法测定药物的生物活性结果 2.2.1 ec50的相关性分析 孢子萌发法和叶碟法测定P3D对黄瓜白粉菌8个菌株A10、A25、A12、A26、B7、C20、C27和C30的EC50的相关性分析结果表明,这两种方法测定的结果有极强的相关性,相关系数高达0.99,达到1%显著水平(图1)。 2.2.2 供试黄瓜糯米粉菌的ec50 和P3D测定的结果一样,用醚菌酯测定的结果也表明,孢子萌发法和叶碟法测定,对供试的黄瓜白粉菌8个菌株的EC50也有很强的相关性,相关系数为0.88,也达到1%显著水平(图2)。 3 子萌发过程中的化合物 采用孢子萌发法测定化合物对黄瓜白粉病菌的生物活性是可行的。白粉病菌是植物专性寄生菌,在人工培养基上很难达到理想的发芽率。尽管有文章报道黄瓜白粉菌在2%葡萄糖溶液中的孢子萌发率能达到63%,但作为生物活性测定是不够的。本方法的孢子萌发率在80%以上,而且与黄瓜子叶法,叶碟法等生物测定方法相比较,测定周期短,培养时间仅需16 h左右,调查时在显微镜下直接计数分生孢子发芽情况,克服了目