机油降解真菌的筛选及降解效果的研究.docx

? ? 机油降解真菌的筛选及降解效果的研究 ? ? 吴燕红，李 聪，石 冀，高焕方 (1.重庆理工大学 化学化工学院， 重庆 400054; 2.重庆汇亚环保工程有限公司， 重庆 400041) 0 引言 机油作为从石油中提炼出来的一种产品，在工业及日常生活中被广泛使用，在生产、运输、使用过程中的跑冒滴漏及突发性泄漏事故，含油污水的随意排放等都对水资源造成了极大的污染[1-2]。机油主要是以多种复杂的碳氢化合物为主要成分的混合物，其中芳香烃对人的危害及毒性尤为突出[3]，会产生致癌、致畸和致突变作用[4]。现有的石油烃污染修复技术主要有化学修复法、物理修复法和生物修复法[5]，其中生物法利用降解菌转化机油中石油烃类化合物，以此达到修复机油污染场地的目的，此方法成本低、效果好且无二次污染[6-7]。 微生物降解石油烃过程复杂，有多种酶参与。石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的[8]。已有许多研究证实真菌可作为石油烃降解菌[9]，其对石油烃的降解能力受石油组分、微生物种类、环境参数等的影响[10-12]。郑金秀等[13]从污染土壤中分离到一株产生生物表面活性剂的菌株，与其他2株不产表面活性剂的菌株对比，能有效提高菌株对石油的降解效率，降解率最多可提高18.3%。目前，关于机油污染水体短时有效的修复技术，尤其对于加入表面活性剂作用的生物强化研究较少。 在筛选石油降解菌的基础上，探讨单一环境因素改变时，筛选出的真菌aspergillusversicolor降解机油的效果，并在此基础上进行生物强化，探索投加表面活性剂进行生物强化降解污染废水中机油的可行性。 1 实验部分 1.1 主要试剂及仪器 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，去离子水定容至1 L，pH=7.0。 牛肉膏蛋白胨平板：牛肉膏蛋白胨培养基中加入1.5%～2.0%的琼脂。 无机盐基础培养基(MSM)：磷酸二氢钠8.5 g，磷酸二氢钾3.0 g，氯化钠4.0 g，氯化铵1.0 g，七水硫酸镁0.5 g，二水氯化钙0.02 g，三氯化铁0.02 g，一水硫酸锰0.004 g，七水硫酸锌0.004 g，硫酸铜0.000 4 g，去离子水定容至1 L。 降解机油液体培养基：无机盐基础培养基加入浓度为2 500 mg/L机油。 试剂：磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、七水硫酸镁、二水氯化钙、三氯化铁、一水硫酸锰、七水硫酸锌、硫酸铜、无水硫酸钠、石油醚(60～90)、无水乙醇等均购自成都市科隆化学品有限公司；牛肉膏、蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司、琼脂购自上海麦克林生化科技有限公司，以上试剂均为分析纯，40#机油(昆仑5w- 40)购自中国石油控股集团昆仑润滑油有限公司，SN级。 仪器：ABI3730XL基因测序仪(上海艾研生物科技有限公司)、高压蒸汽灭菌器-BIOBASE(山东博科生物产业有限公司)、Boxun博迅vs-840-2单人双面垂直净化工作台(苏州赛恩斯仪器有限公司)、SHP-100生化培养箱(上海精其仪器有限公司)、SHZ-82气浴摇床(江苏中和实验仪器制造有限公司)、UV756CRT紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。 1.2 实验方法 1.2.1菌种的筛选及鉴定 筛选：菌株筛选于重庆某场地石油烃污染土壤，取污染土壤10 g于含油无机盐培养基中富集，后取其上清液在含无菌水试管中10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，各取1 μL稀释液在牛肉膏蛋白胨平板上进行涂布平板，后平板划线纯化出几株对机油具有降解效果的单菌株，比较其降解效果，筛选出的菌株为真菌aspergillusversicolor。 ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’引物对样品DNA进行扩增，采用Sanger法对PCR产物测序，PCR产物条带大小约为500～750 bp，采用双向引物测序，结果采用DNAMAN软件6.0进行拼接处理，在NCBI数据中的BlastBI进行序列比对。 1.2.2机油降解率的测定方法 水中机油的提取：把样品移入分液漏斗，量取10 mL的石油醚润洗锥形瓶，后倒入分液漏斗中，充分震荡3 min，期间需经常开启旋塞排气，静置至液液分层，将下层液体转移至烧杯中，重复上述步骤萃取3次，将萃取液体转移至同一个烧杯[14]。在烧杯中加入450 ℃、4 h烘干后的无水硫酸钠，补加至其呈流沙状，后过滤至25 mL容量瓶，经稀释后使用紫外可见分光光度计测定其吸光度。 紫外可见分光光度计标准曲线绘制：精确称取0.1 g的机油，配置成100 mg/L的标准溶液，稀释为浓度是5、10、20、30、40、