铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪骨髓间充质干细胞的mr成像.docxVIP

铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪骨髓间充质干细胞的mr成像 在过去10年中，移植树干被广泛用于缺血性心脏病、晚末期心力衰竭、糖尿病和中枢神经系统退行性病变的动物实验和临床试验，以及移植后干预细胞的分布、运动、分化和预后。传统上多采用荧光染料或染色体等作为标志物对干细胞移植进行示踪,但只能在离体状态下通过组织学检查来实现。近年来分子影像学和无创性活体示踪技术获得一定的发展,其中超顺磁性物质标记干细胞后进行MR显像和示踪具备空间分辨力更佳、可长期示踪等优点,似具有更大前景。加之近年来MR对比剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)研究取得进展,利用SPIO作为分子探针标记干细胞并进行移植后的MR活体示踪是可能的。 本实验采用铁羧葡胺(SHU555A,商品名Resovist)纳米微粒标记猪骨髓间充质干细胞(MSC),在确定标记效率和安全性的基础上,探讨了磁标记干细胞的体外MR检测阈值、MR信号与细胞数量及细胞增殖的关系,并对植入心脏磁标细胞的MR活体显像示踪进行了初步研究。 1 材料和方法 1.1 聚赖氨酸亚铁氰化钾缓冲液和多聚甲醛、中性红 淋巴细胞分离液(加拿大Cedarlane公司),DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司),SHU555A,(德国Schering公司),多聚赖氨酸(PLL,美国Sigma公司,平均分子量275 ku),亚铁氰化钾、中性红(美国Sigma公司),多聚甲醛、磷酸盐缓冲液(PBS,上海钰森生物技术有限公司)。水浴箱(德国Hettich公司),倒置相差显微镜(TS 100,Nikon),Thermo E.IRIS Duo ICP发射光谱仪,MR扫描仪Magnetom Avanto 1.5 T(Siemens公司)。 1.2 细胞分离和培养 无菌条件下猪髂后上嵴多点抽取骨髓液40～80 ml,置于含肝素的50 ml离心管中混匀,200目滤网过滤后,室温2500转/min离心5 min,平头吸管反复抽吸吹打制成单细胞悬液,将骨髓液沿壁轻轻叠加到密度1.077 g/ml的淋巴细胞分离液上,4℃2000转/min梯度离心30 min,吸出中间2～3 mm厚的白绒层,离心洗涤,加入完全培养基(DMEM+10%胎牛血清+双抗含100 mg/L青霉素及100 mg/L链霉素)中充分混匀,并将分离得的细胞接种于75 cm2塑料培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中进行培养,72 h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每48～72 h全量换液。细胞长到80%融合时用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化并按照1:2比例传代,取第3代细胞作磁标记。 1.3 shu65a-pll扩增 将SHU555A和非特异性转染剂PLL (平均分子量275 ku)用无血清的DMEM培养液稀释,制成终浓度为25:0.75μg/ml的SHU555A-PLL标记培养液,室温下轻摇混合60 min形成SHU555A-PLL复合物。然后用SHU555A-PLL复合物全量换液猪SMCs,置于5%CO2培养箱中孵育24 h。 1.4 细胞外铁和pelr反应 取少许标记后0、4、8、12、16和20 d细胞以及未标记细胞沉淀,经PBS洗涤3次(去除细胞外铁)后,4%多聚甲醛固定15 min,蒸馏水洗涤3次;Perl反应液[2%K3(CN)6+6%HCl]中作用30 min,蒸馏水洗涤3次;1%核固红复染3 min,蒸馏水洗去多余的核固红,显微镜下观察结果。 1.5 高氯酸-羧酸混合物传导剂 取标记后不同时间点的细胞各1×105个,离心沉淀110℃干燥过夜,加入500μl高氯酸-硝酸混合物(3:1),60℃消化3 h以上,以彻底破坏细胞。原子吸收分光光度仪测定铁离子浓度,以pg Fe/细胞表示。每种条件均测定3个样品。 1.6 胞各细胞计数 取标记后0、4、8、12、16和20 d细胞以及未标记细胞各5μl悬液,分别与0.4%锥虫蓝溶液5μl混合,1 min后滴入细胞计数板,镜下观察,计数100个细胞。细胞活力(锥虫蓝拒染率)=染色阴性细胞数/100个细胞×100%。 1.7 铁标细胞检测阈值检测 用0.25%胰蛋白酶消化后收集将未标记细胞、不同数量标记细胞(1×106、5×105、1×105、5×104、1×104)和标记后培养不同时间的细胞(标记后培养4、8、12、16和20 d),分别重悬于0.3%琼脂糖0.5 ml的EP管中,冷却凝胶形成后MR成像。另外将150μl含不同细胞量(1×106、5×105、1×105、5×104、1×104、5×103、1×106未标记细胞)的细胞沉淀注入凝胶MR成像,判断体外铁标细胞检测阈值。采用Magnetom Avanto 1.5 T(Siemens公司),头线圈;视野(FOV)90 cm2;激励次数2～