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固氮菌剂的制备 随着我国绿色植物和食品的发展，对绿色肥料的生产有了高需求。减少化肥的使用，发展农业可持续发展，改善土壤和环境。 1 固氮菌粉末的制造液体呼吸 1.1 调整溶液ph 蒸馏水10L,白糖200g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁2g,氯化钠1g,碳酸钙30g,调整溶液pH=7。 把菌种及消过毒的培养液移入无菌室中,接种,于28℃保持1～2d,经常摇动促进繁殖,为第一代菌种,亦可进行第二代,第三代菌种培养,以备接种用。 1.2 接种及打气培养法 液体培养液制备之后,装入培养筒内,经10.3kPa压力,高温杀菌30min,移到无菌室进行接种(倒入菌液20mL),加盖,把培养筒放在保温室内,28℃保温,用打气机进行打气培养,经36～48h,检查每毫升菌液中有固氮菌4～8亿,就可取出搅拌泥炭做成固氮菌剂。 1.3 营养液的制备 泥炭晒干(河泥25kg,堆肥17.5kg,草木灰7.5kg比例)→初步切碎→烘干消毒→粉碎过筛→配料搅拌。(营养液配料:水10kg,砂糖1.6kg,硼酸8.4kg,钼酸铵8.4g,过磷酸钙4.5kg)。 泥炭950kg,碳酸钙粉50kg,菌液20L,营养液213kg。 2 细菌检验 2.1 染色液的制备 结晶紫原液:结晶紫7g,95%酒精100mL,把结晶紫原液20mL与1%草酸铵80mL混合,成为结晶紫染色液。 路哥尔氏液:结晶碘1g,碘化钾2g,水300mL。 沙黄原液:每1mL沙黄原液配10mL水。 2.2 固氮菌的形态 取出干净的载片,先用1%无菌澄清氯化钠液滴一滴在载片上的中央处,再用白金丝从培养基上刮取一点放在1%氯化钠中稀释,放在600倍显微镜中观察其菌种形状和大小特征。 固氮菌菌形是不一致的,变化很明显。在显微镜下观察,常见是单球,双球、三球、四球或几个球菌连在一起形成链球形;有明显的荚膜,球菌中有萤光。体积约为0.5×1μm。固体培养基中,大部分是由两个球菌连在一起形成“8”字型;在液体培养时,大部分是单球形及几个球菌连在一起形成链球形。 2.3 细菌的生理评价 (1) 细菌活动能力的测定 把细菌接种在培养基上培养24h,菌落产生,用600倍显微镜观察细菌在液体中的活动能力,游动的快慢,细菌的纯度、变化等,同时进行记载,编列菌号。 (2) 固氮菌的检测 糖类发酵 培养基:糊精10g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.1g,碳酸钙3.3g,酵母粉0.1g,水1L,洋菜15～18g。 上列培养基经10.3kPa压力30min消毒后,进行接种,培养2～3d后用溴甲香草酚兰测定,若是中性反应呈浅兰色,碱性反应兰色,酸性反应黄色或红色。固氮菌呈中性至微碱性反应。 石蕊脱脂牛乳 取脱脂牛乳粉100g,溶解在1L水中,加1mL 25%石蕊,分装于若干试管中,放在高压杀菌器用10.3kPa压力30min,迅速放冷,再放入冰箱中,经过一星期变成紫红色,若为红色为失败,须重做。从冰箱拿出后,于恒温箱以28℃保温24h后接种,固氮菌有些品种接种后,在10～14d内变成澄清透明。 固氮菌能力的测定 培养基:葡萄糖20g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,碳酸钙5g,洋菜15～18g,清水1L。 取出上面培养基100mL,放在250mL三角瓶中,经高压杀菌后,以5～10mL菌液接种,放入28℃的保温箱培养5～6d,待菌落发育全面就可进行测氮分析。可按GB/5009.5-85,食品中蛋白质的测定方法进行测定氮含量。 消耗糖能力的测定 可按GB5009.7-85食品中还原糖的测定进行。 (3) 种间生长筛选 把培养基放入试管中,经高压杀菌后,用白金丝接种,然后定温培养3～4d,好气细菌在表面发育生长,嫌气细菌在培养基中间生长,若中间有空泡或把培养基断裂为二段,均为嫌气细菌活动现象。 (4) 耐酸碱能力测定 测定细菌耐酸与耐碱的能力可在培养基中加入不同浓度的酸或碱,并测定pH值,然后接种培养,经数天观察,即可知其耐酸碱能力。固氮菌最适宜的pH值为6.8～7.5。 (5) 计算的细菌数 用菌数计数器计算菌落总数要大于6亿。 2.4 固氮菌的染色 (1)要鉴别固氮菌,用7%碘溶液进行活菌染色(不要固定),经染色固氮菌呈深黄色,此外还可以用墨汁染固氮菌,因有明显的荚膜,可以与其他细菌进行区别。 (2)经革兰氏染色后,固氮菌呈阴性或阳性者都有,通常是紫红色。 (3)在培养基中常常加入酵母粉或酵母浸液,要检查消毒后酵母菌是否被杀死,可用次甲基兰染液进行染色检验。能染色为死菌,不能染色为活菌。