覆盆子苷-F3抗血管生成作用的研究.docxVIP

? ? 覆盆子苷-F3抗血管生成作用的研究 ? ? 周年，周萍，任琦，赵敏敏,2，刘宁，付辉政 1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004 覆盆子是蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子Rubus chingii Hu 的干燥未成熟果实，具有补肾、固精、明目之功效。作为江西省道地药材，覆盆子在江西省德兴市进行了规模化栽培，其中德兴覆盆子已登记为全国农产品地理标志。现代药理研究表明覆盆子具有显著的抗肿瘤作用，但作用机制仅局限于体外抑制肿瘤细胞增殖［1-2］。中药作为我国独特的天然药物宝库，国内已有许多文献报道如薏苡仁、姜黄等具有抗血管生成作用［3-4］，而覆盆子分离的化合物抗血管生成的作用尚未见文献报道。抗血管生成可切断肿瘤恶性生长的供养途径，并阻断肿瘤侵袭转移的血行通道，有效遏制肿瘤的恶性发展［5］。肿瘤与血管形成有着密切的关系，其中血管内皮细胞的迁移和增殖是血管形成的关键步骤。本课题组前期采用MTT 法对覆盆子分离的化合物体外抗肿瘤的活性进行评价，筛选出抗肿瘤活性较强的化合物覆盆子苷-F3。在此基础上，以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作为研究对象，采用MTT 法筛选出具有明显差异细胞毒性的活性化合物，并进一步通过细胞划痕、体外血管生成实验考察其对HUVECs 迁移能力和血管生成能力的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 RPMI1640 完全培养基（批号WP15，上海语纯生物科技有限公司）；噻唑蓝（MTT）（批号723A051，上海语纯生物科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（批号BCBN0845V，美国Sigma 公司）；ECM 专用完全培养基（批号34356，Sciencell）；重组人源血管内皮生产因子（rh-VEGF165）（批号B211228，北京博尔西科技有限公司）；基质胶（批号BP2107002Z220224，Biozellen）；肝素钠（批号605K021，北京索莱宝科技有限公司）；紫杉醇（批号1534-200001，中国药品生物制品检定所）；康莱特注射液（批号2110247-2，浙江康莱特药业有限公司）。 1.2 细胞株 Bel-7402 细胞来源于上海语纯生物科技有限公司，置RPMI1640 完全培养基（89%RPMI1640 培养基+10%胎牛血清+1%双抗），37 ℃恒温、5% CO2饱和湿度培养箱中生长；HUVECs 来源于上海语纯生物科技有限公司，于ECM 专用完全培养基（88%基础培养基+10%胎牛血清+1%内皮细胞生长添加剂+1%双抗），37 ℃恒温、5% CO2饱和湿度培养箱中生长。分别取处于对数生长期的Bel-7402 细胞，第二代至第五代之间的HUVECs 用于后续实验。 1.3 仪器 Multiskan go 酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；IC1000 细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；XDS-1 倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；BS224S 电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；311 型CO2培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）。 1.4 MTT 法对覆盆子分离的化合物体外抗肿瘤活性的筛选 本次研究取华东覆盆子，利用各种色谱方法进行分离纯化，经鉴定后共分离得到17 个化合物［6］。经前期药效初筛选取覆盆子苷-F3 化合物，经连续2 倍稀释成6 个稀释浓度后备用。以紫杉醇作为阳性药，用培养基配制成0.03 μg/mL。将Bel-7402 细胞以5×103/孔接种于96 孔板中，每孔100 μL，培养24 h 后，依次吸弃上清液，更换为上述配制的覆盆子苷-F3 化合物溶液，设6 个复孔，24 h 后吸弃上清液，每孔加入含MTT（终浓度为0.5 mg/mL）的培养基100 μL，继续于CO2培养箱培养4 h 后，吸弃孔内液体，加入150 μL DMSO，孵育1 min，震荡5 min，在酶标仪上测定波长490 nm 处的吸光度值，计算细胞相对存活率（细胞存活率=给药组A490nm值/对照组A490nm值的均值×100%）。 1.5 覆盆子苷-F3 化合物对HUVECs 生物学行为的影响 1.5.1 细胞活性实验实验分为经rh-VEGF165（+）处理和无rh-VEGF165（-）处理两类，前者以rh-VEGF165（4 ng/mL）与覆盆子苷-F3 同时加入HUVECs 培养24 h，以rh-VEGF165（4 ng/mL）与ECM 专用完全培养基同时加入HUVECs 培养24 h作为对照组；后者除不添加rh-VEGF165 外与前者