一种基于线粒体12srrna基因序列的乌梢蛇鉴别方法.docxVIP

一种基于线粒体12srrna基因序列的乌梢蛇鉴别方法 兔子是《中国药典》（2005年版）中常用的一种中药，来自老虎科动物的乌梢蛇。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。 鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切,但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状,我们对市场上乌梢蛇药材流通情况进行了调查。商品流通中多以红点锦蛇[Elaphe rufodorsata(Cantor)]、黑眉锦蛇[Elaphe taeniura(Cope)]、玉斑锦蛇[Elaphe mandarinus(Cantor)]、王锦蛇[Elaphe carinata(Guenther)]、灰鼠蛇[Ptyas korros(Schlegel)]等来混作正品药材进行销售,这些品种多数与乌梢蛇同科不同属,因其来源相近,造成鉴定困难。此外,药材在加工处理时剖去内脏后,要进行干燥熏黑处理,皮上的花纹特征、颜色几近消失,难以辨认,而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近,这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。随着分子生物技术的发展,利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材的真伪已成为可能。王义权等通过对乌梢蛇及其混淆品线粒体Cyt b基因进行测序,通过对测序结果的比对分析来鉴别乌梢蛇的真伪,但因对DNA进行测序成本较高,操作有难度,不同人的测序结果会存在偏差,所以在实际应用中适用性不强。为了深入乌梢蛇类药材分子遗传标记鉴别研究,满足目前市场常见混伪品的鉴别要求,寻找更为经济实用、准确便捷、稳定性高的方法,本实验用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。 1 材料和方法 1.1 材料表面 用于高特异性PCR鉴别方法学研究的实验材料见表1。乌梢蛇炮制品购自北京同仁堂、北京京隆堂、北京阳光同仁药房、北京金象大药房。 1.2 乌梢蛇12srrna扩增引物和hwl-1和hwh-1引物的设计 从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混伪品黑眉锦蛇、红点锦蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、赤链蛇、玉斑锦蛇、赤链华游蛇、王锦蛇、滑鼠蛇、原动物线粒体12S rRNA基因序列(GenBank登录号依次为:AF236676,AF233940,AF236675,AF236680,AF236683,AF233939,AF236670,AF236677,AF236674,AY122828),经DNAMAN软件对位排列分析正、混品间DNA序列差异,设计出一对能特异性扩增乌梢蛇12S rRNA基因片段的特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1(上海生工生物公司合成)。乌梢蛇及其混淆品12S rRNA序列(约800 bp)的部分序列,见表2。 1.3 模型dna提取 取乌梢蛇及混淆品原动物和炮制品(醋炙乌梢蛇段)的干燥肌肉组织约1 g,参照王义权等方法提取DNA模板。 1.4 pcr扩增条件 PCR反应体系25 μL,其中10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.3),50 mmol·L-1氯化钾,Mg2+1.5 mmol·L-1,dNTP 各 0.15 μmol·L-1,Taq 1 U(Takara Ex Taq),引物各0.15 μmol·L-1,模板DNA 50 ng。循环参数:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性40 s,55～65 ℃复性1 min, 72 ℃延伸30 s;25个循环; 72 ℃延伸5 min。PCR反应选用不同的复性温度以寻找合适的PCR鉴别反应参数。实验中设置无DNA模板的阴性对照。取5 μL反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外凝胶分析检测,成像。 同时用扩增约400 bp的12S rRNA基因片段的通用引物(L1091 5′AAACTGGGATTAGATAC-CCCACTAT3′和H1478 5′TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT3′)在55 ℃的复性温度下对上述用于PCR鉴别的模板DNA作阳性扩增对照。 2 结果 2.1 pcr检测dna质量 乌梢蛇药材及混淆品原动物和炮制品(醋炙乌梢蛇段)提取的DNA模板用通用引物L1091和H1478扩增,得到约400 bp扩增带(图1),表明样品中模板DNA质量符合PCR反应的要求。 2.2 乌梢蛇、赤链蛇同时扩增带的选择 用鉴别引物PCR扩增乌梢蛇原动物样品的DNA,当复性温度为55 ℃时,乌梢蛇的正品有两条带,玉斑锦蛇、红点锦蛇、三索锦蛇有1条很弱的带(图2A);当复性温度为60 ℃,乌梢蛇、赤链蛇同时扩增出一条带(图2B);当复性温度升至65 ℃,25个循环时,其反应具有高度特异性,仅正品乌梢蛇有良好的单一扩增带,其余样品皆无扩增带出现。当退火和延伸温度合并为68 ℃时,正品也未见扩增带出现。故特异性PCR循环参数确定为:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性4