微生物分离纯化（食品微生物课件）.pptx

情境：分离纯化技术任务：分离纯化培养知识点：常用分离纯化技术课程：食品微生物技术 平板划线分离 1.目的了解平板划线法分离菌种的基本原理；练习平板划线法分离菌种的基本操作；掌握无菌操作技术。2.原理平板划线分离法，是指把杂菌样品通过在平板表面划线、稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。一、平板划线分离 通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。?平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜。 具体的划线形式有多种，常用方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。 3.材料和器皿（1）菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia?coli ）和枯草芽孢杆菌（ Bacillus?subtilis ）的混合培养斜面菌种。（2）培养基 伊红美蓝琼脂培养基。（3）器皿 无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。? 4.方法步骤（1）融化培养基 将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。（2）倒平板 待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板（每皿约倒15ml），平置，待凝。 操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 （3）划线操作 ①挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。②先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。 ③划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区（菌源区）而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行（但不能与A区或B区的线条接触！），最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。 （4）恒温培养将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。（5）挑单菌落良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。（6）清洗、处理清洗培养皿，将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。? 5.注意事项 ①平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 ②用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 ③用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。 ?④为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。 涂布分离培养技术 三、涂布分离培养技术1、定义及特点 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数。 例如：测定纯净水中大肠杆菌的含量。 一、涂布分离培养技术2、操作方法 用移液管或移液枪分别取适合稀释度液（一般取3个梯度）1mL于倒好培养基且凝固好的培养皿中，用无菌涂布棒将稀释液充分涂开，待干。每个稀释梯度一般2~3个平行。 稀释平板分离培养技术 二、稀释平板分离培养技术稀释平板分离法 首先把微生物悬液作一系列的稀释液（如1:10、1:100、1:1000），取1:1000稀释液1ml置于灭菌的平皿中，然后倾注熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基，摇匀后待琼脂凝固，制成含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现单个菌落。