支气管哮喘患者淋巴细胞接触特异性过敏反应增殖的研究.docxVIP

支气管哮喘患者淋巴细胞接触特异性过敏反应增殖的研究 气管哮喘是一种由各种细胞和细胞组成的慢性呼吸道炎症疾病。参与气道炎症的细胞有嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等,其中T淋巴细胞对气道炎症起主要调控作用,B淋巴细胞是IgE合成的主要细胞,因此接触过敏原后,淋巴细胞的增殖、分化及反应决定着过敏性哮喘疾病的发展、变化和转归。以往对淋巴细胞的研究是观察体外培养时经非特异性促分裂素[如植物血凝素(PHA)等]刺激时细胞增殖和释放细胞因子的状况。而用特异性抗原刺激则更接近疾病的真实状况,但至今尚无过敏性疾病患者外周血淋巴细胞受特异性过敏原刺激时淋巴细胞增殖方面的研究,因此本研究采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测对粉尘螨过敏的支气管哮喘患者外周血淋巴细胞在接触特异性过敏原后的增殖反应情况,并为进一步开展其他研究探索实验条件。 材料和方法 一、 材料表面 1. 气管哮喘患者e检测 经过敏原皮试证实对粉尘螨过敏(皮试≥2+)并经粉尘螨特异性IgE检测呈阳性,符合哮喘诊断标准的,轻、中度持续期支气管哮喘患者12例,男女相等,平均年龄(40.7±13.8)岁,1周内未全身使用糖皮质激素及其他免疫抑制剂,抽血前12 h内未使用任何药物。 2. 测定试剂与仪器 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);台盼蓝(Sigma);MTT(Sigma);二甲基亚砜(DMSO,上海凌峰化学试剂有限公司);RPMI-1640(GIBCO公司)。ESTAR plus全自动酶标仪(Co-Wealth Medical Sciences Biotechnology INC. 台湾);CO2培养箱(REVCO SCIENTIFIC INC.美国);超净工作台(上海净化设备厂);LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂)。 二、 方法 1. 纯蛛材料的制备 粉尘螨从原江西医学院变态反应研究室刘志刚教授处引进,本室饲养繁殖,饲养条件为温度25 ℃、湿度80%,生化培养箱中培养4周,将长出的螨连同饲料一起移入装有新鲜饲料(含酵母粉5%)的玻璃缸中,相同条件下再培养4～6周,重复以上过程,即可获得大量纯螨材料。 2. 蛋白质浓度的测定 取纯培养粉尘螨适量,略做研磨,乙醚脱脂过夜,25 ℃真空干燥后称重,按1∶50(W/V)用生理盐水浸泡,并4 ℃磁力搅拌48 h,12 000 r/min离心10 min后取上清,测蛋白质浓度,-20 ℃保存待用。 3. 细胞系统检测 无菌抽取肝素抗凝静脉血5 mL,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC),贴壁培养1 h,吸出混悬部分,台盼蓝拒染试验检测活细胞数90%;用含10%小牛血清的RPMI-1640调整T淋巴细胞浓度为1×105～2×105/mL,接种于24孔培养板内,每孔1 mL。将淋巴细胞分为2组:一组为空白组(即不含过敏原组),另一组为过敏原刺激组(再下分6个剂量组,各组粉尘螨抗原浓度分别为1、5、10、20、40、80 μg/mL),于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养24～72 h。 4. tt-pcr检测细胞培养细胞后总糖含量和检测方法 (1) MTT试剂的配制:用pH值7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配制成5 mg/mL,0.22 μm滤器过滤除菌,4 ℃避光保存;(2) 30% DMSO的配制:用pH值7.4 PBS配制成30%的浓度;(3) 检测过程:吸取过敏原刺激培养24、48和72 h的淋巴细胞加入96孔板,细胞浓度为1×105～2×105/mL,每孔100 μL,以对照培养淋巴细胞为对照组,各做3个复孔,并设空白不含细胞的完全培养基孔。分别于各孔加入10 μL(5 mg/mL)MTT,37 ℃继续培养4 h后,1 000 r/min离心5 min,去上清,再于各孔中加入30% DMSO 100 μL,避光振荡20～30 min以确保蓝色沉淀溶解。在酶标仪上取检测波长570 nm,参考波长630 nm,读取吸光度(A)值。将刺激孔和对照孔各自平均A值按下式计算刺激指数(SI):SI=刺激孔A值-空白孔A值/对照孔A值-空白孔A值。 三、 统计方法 应用SAS统计软件包进行统计分析。结果比较的显著性检验采用配对t检验,数据用xˉ±sxˉ±s表示。 常激素-1 不同培养时间、不同过敏原浓度下,淋巴细胞的增殖效力不同。当粉尘螨浓度在1～10μg/mL范围内时,淋巴细胞的SI随粉尘螨浓度的增高而增高,当浓度10μg/mL时淋巴细胞SI下降;在粉尘螨浓度1～10μg/mL范围内,培养48h时淋巴细胞SI达峰值。亦即以粉尘螨刺激48h、浓度为10μg/mL时,哮喘患者淋巴细胞SI最高。见表1和图1。 mtt法的临床应用 测定淋巴细胞体外增殖反应和释放细胞因子是检测细胞免