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n端氨基酸序列测序研究进展 氨基酸序列的测定是了解蛋白质性质和功能的重要路径。氮和氨基酸是重要的结构和功能部位。序列具有很高的特异性。我们可以通过在n端少数氨基酸残基中测定某些氨基酸。例如, 可以通过对蛋白质和多肽类药物的N端进行人工修饰 (如环化修饰、甲基化修饰等) , 提高其降解稳定性延长药效。因此N端肽段的鉴定具有非常重要的意义, 本文对近年来蛋白质和多肽N端测序技术及方法进行了综述。 1 核心组蛋白的td-4/d定位与操作 所有蛋白质合成都起始于N端, 其序列组成对其生物学功能有着巨大的影响。 (1) 蛋白质的半衰期与N端氨基酸的特异性有关, 或者说N端氨基酸残基对蛋白质的寿命有控制作用; (2) N端序列与蛋白质的亚细胞器定位有密切关系, 例如, 某些特殊的氨基酸序列可以作为蛋白质分选标记影响蛋白质定位; (3) 蛋白质的N端可发生许多种翻译后修饰, 影响其结构和功能。如在新生肽链的成熟过程中, 2/3的叶绿体蛋白质会发生起始甲硫氨酸残基的剪切和前导肽的去除;又如核心组蛋白N端赖氨酸的可逆乙酰化修饰使组蛋白与DNA间的作用减弱, 导致染色体局部解旋, 促进基因转录, 而去乙酰化则抑制基因转录。这种乙酰化和去乙酰化过程中的任何异常都会导致生长、发育的紊乱, 诱发白血病、皮肤癌等疾病。因此, 通过对蛋白质N端序列的研究有利于分析蛋白质的高级结构, 揭示蛋白质的生物学功能。 2 蛋白质和茶多酚n端测量技术 2.1 edan降解 1955年, Frederick Sanger采用二硝基氟苯 (FDNB) 法, 首次成功地完成了第一个蛋白质——牛胰岛素的序列分析。在此测序方法的基础上, 瑞典有机化学家Edman提出了蛋白质N端顺序测定方法——Edman降解。之后随着基于此原理的液相、固相及气相自动蛋白质序列分析仪的推出和逐步完善, 经典的Edman降解法已经广泛应用于蛋白质的N端测序。Chen等在微流控芯片上进行Edman反应, 使得肽段测序的灵敏度提高到亚飞摩尔水平;并利用Edman反应2次循环得到肽段的串联质谱 (MS/MS) 图的b2离子为内标, 获得了更好的二级质量准确度, 实现了肽段快速、可靠的测序。 但Edman降解方法受到以下诸多限制: (1) 用于序列分析的蛋白质或多肽必须是高纯度的; (2) N端封闭的蛋白质难以进行Edman反应, 虽然出现了一些去除N端封闭基团的方法, 例如用蛋白酶去除N端焦谷氨酸和通过酸催化的亲核取代去除N乙酰化丝氨酸和N乙酰化苏氨酸残基等, 但都只适于一定残基的特定修饰, 没有普遍适用性, 且许多末端残基修饰是无法移去的; (3) 不适于高通量分析, 灵敏度不够。但是Edman降解对于整体纯化的蛋白的N端序列分析仍是很有价值的研究工具。 人们还利用RT-PCR从编码蛋白质的m RNA得到其c DNA序列, 再根据遗传密码表反推出其相应的氨基酸序列。20世纪80年代出现了从基因组中找出编码蛋白质的基因, 测定其DNA序列, 再反推出蛋白质的氨基酸序列的技术。其特点是更加简便、快速, 但利用RT-PCR或测定基因组的碱基序列也不能完全描述蛋白质的一级结构, 它对翻译加工所导致的氨基酸残基的修饰及突变等情况无能为力。 2.2 激光解吸放电-飞行时间技术的应用 质谱 (MS) , 尤其是电喷雾 (electraspray ionization, ESI) 和基质辅助激光解吸电离-飞行时间 (matrix-assisted laserd desorption/ionization time-of-fight, MALDI-TOF) 的出现, 使质谱技术在蛋白质结构分析中的应用发生了革命性的飞跃。高灵敏度、高准确性、高分辨率和高通量的生物质谱技术为蛋白质的N端测序提供了一种重要的选择。 2.2.1 氨基酸序列的确定 是间接肽序列测定技术, 通过末端酶解或化学降解产生一组相互之间仅差一个氨基酸残基的多肽系列, 经MALDI-TOF MS鉴定后, 根据所得到的肽阶梯图中各肽段的相对分子质量差值确定末端的氨基酸序列, 从而用于数据库查询。阶梯测序是最早探索用质谱进行蛋白质测序的例子, 经过几个Edman反应循环的肽段混合物被MALDI MS检测, 原始肽段的序列就可从质谱测得的梯形序列里得到阐明。另外, Zhong等还提出了质谱结合微波辅助酸水解的阶梯式测序方法, 通过25%的三氟乙酸溶解蛋白质, 用普通微波辐射10 min后, 用质谱直接检测其酸水解的梯度产物进行蛋白质序列的分析。 2.2.2 磺酸基修饰n端肽 许多对末端肽的研究方法采用的是质谱技术与多种化学方法及生物酶法的结合, 通过N端的各种化学标记, 运用MS/MS或多级质谱 (MSn) 的碰撞诱导裂解 (collision induced