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基于srap标记的杜梨种子诱变研究 梨柏树是世界上最重要的果树种类之一。2012年中国梨的栽种面积为108.55万hm2, 梨产量达到了1 579万t, 为世界上梨产量最高、面积最大的国家。梨为落叶乔木, 树体较大, 而且结果周期较长, 因此, 梨的新品种选育不仅需要的时间长, 而且土地及劳动力投入耗费大。目前, 中国梨品种选育方式主要包括杂交育种、芽变选种、实生选种、辐射育种等。以上梨品种培育方法中除了辐射育种, 其他育种方式的效率都较低, 难以满足育种和生产实践的需求。此外, 由于梨自身产生突变的效率比较低, 难以获得类似模式植物的突变体材料用于重要性状的内在机制研究, 因此, 开展梨突变体的创制具有重要的实践和科学意义, 是十分重要的研究工作。甲基磺酸乙酯 (EMS) 是目前应用最为广泛, 效果最佳的化学诱变剂之一, 其诱变后代的突变频率高, EMS处理玉米Zea mays花粉, 突变频率高达78%, 且多为显性突变, 易于突变体的筛选。EMS已成功应用于水稻Oryza sativa, 油菜Brassica napus等10多种植物诱导突变体[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15], 但在梨上的应用还未见报道。为了探索适宜梨的突变体诱导技术体系, 本研究采用不同体积分数的EMS溶液处理杜梨Pyrus betulaefolia种子, 通过对种子萌发、遗传位点变异率鉴定, 以及幼苗生长发育状态等检测, 筛选最适宜的EMS诱变处理体积分数, 以期获得梨的突变体, 为梨新品种的选育以及特异性状分子基础研究提供资源和种质材料。 1 材料和方法 1.1 材料表面 供试材料为杜梨种子, 采集于南京农业大学国家梨工程研究中心江浦实验基地。EMS药剂由美国Sigma公司生产。 1.2 种子露白处理 使用砂藏法层积2 000粒杜梨种子, 温度为4℃, 湿度为60%, 层积时间为40 d, 在发现种子有80%左右尖端露白时即可使用EMS药剂进行处理。处理前先用蒸馏水将河沙洗净, 再用蒸馏水浸泡24 h。 1.3 pse-ms法 将杜梨种子随机分成10组, 200粒·组-1, 放入锥形瓶中。使用0.1 mol·L-1, p H 7.0的磷酸缓冲液配置EMS溶液, 各组EMS的体积分数依次为0 (ck) , 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%和0.9%。将配置好的EMS溶液分别加入各组, 将锥形瓶口封住, 摇匀, 处理24 h后使用硫代硫酸钠清洗种子15 min, 再用双蒸水清洗15 min, 将种子晾干后, 播种, 种子出芽时统计出芽率。 1.4 dna提取与检测 随机选取梨苗20株·组-1, 于春季采集幼嫩叶片, 液氮速冻后保存于-70℃。使用改良的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 法提取DNA, 在10.0 g·kg-1琼脂糖凝胶上进行电泳检测DNA质量, 使用Nanodrop超微量分光光度计调整质量浓度至50 mg·L-1, DNA样品保存于-20℃。 1.5 pcr扩增启动 从通用的相关序列扩增多态性 (sequence-related amplified polymorphism, SRAP) 引物中筛选出多态性较好, 条带较为清晰的10对引物, 并对它们进行编号 (表1) , 检测EMS处理后杜梨幼苗的遗传变异频率, 并进行重复验证。聚合酶链式反应 (PCR) 体系 (25.0μL) :10×PCR缓冲液 (Mg2+) 2.0μL, 2.5mmol·L-1d NTP 1.6μL, 各引物0.6μL, 50~100 ng DNA模板, Taq酶1.0×16.67 nkat (药剂购于Taka Ra公司) 。PCR扩增所用程序:94℃预变性4 min, 94℃, 1 min, 35℃, 1 min, 72℃, 1 min, 5个循环, 94℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃1 min, 34个循环后72℃延伸8 min, 应用Sensoquest Labcycle PCR仪器进行扩增。 取PCR产物1.5 u L点样于质量浓度为0.8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离, 以恒定功率80W, 电泳2.5 h, 染色液染色15 min, 显色液显色15 min后拍照记录。观察电泳图谱, 将各对引物变异位点处有条带的记为“0”, 无条带的记为“1”, 将数据录入Excel表格中, 计算变异条带总数和变异平均值。 1.6 植株高度和节长测定 幼苗定植田间后, 定期管理幼苗, 分别于2012年12月和2013年12月, 测量所有梨苗的植株高度和节间长度, 计算各组植株高度均值和平均节间长度, 并进行差异显著性分析。 2 结果与分析 2.1 半致死剂量对