淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨和下丘脑不同核团ermrna表达的影响.docxVIP

淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨和下丘脑不同核团ermrna表达的影响 骨质疏松症（op）是一种以骨量少和骨微观结构退化为特征的特征，导致骨脆弱和全身骨的代谢疾病。雌激素缺乏导致骨吸收亢进,是绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis ,POP)的主要病因,以往多采用雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy,ERT),但是,近年来研究显示ERT有增加乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的风险,因此,从植物来源的选择性雌激素受体调节剂( selective estrogen receptor modulator,SERM),即植物雌激素逐渐引起学者的兴趣。前期研究表明,由淫羊藿组成的补肾复方在抑制骨量丢失,改善骨密度方面有明显疗效;体外实验也证实淫羊藿总黄酮可以促进成骨细胞增殖与分化、抑制破骨细胞的分化和吸收功能。众多学者对于淫羊藿抗骨质疏松作用的研究以总黄酮及总提物为主,2010年《中国药典》指定淫羊藿苷(Icariin,ICA)为淫羊藿(Epimedii folium)的质量鉴定指标,目前ICA对骨和下丘脑ERβ mRNA表达量的影响国内外研究较少。深入研究ICA对去卵巢所致的骨质疏松大鼠骨和下丘脑不同核团ERβ mRNA的调节,对于研究淫羊藿抗骨质疏松作用机制具有非常重要意义。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验动物 健康10～11 月龄SD ♀大鼠60 只,体质量(400±50) g ,由河北医科大学实验动物中心提供。 1.1.2 乙醇-水梯度洗脱 小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornuMaxim)干燥地上部分45 kg,用10倍量水回流提取2次,每次2 h,经大孔吸附树脂柱色谱分离,体积分数为0%、30%、50%、95%乙醇-水梯度洗脱。取50%乙醇洗脱部分浸膏1.2 kg,用硅胶柱色谱分离,氯仿- 甲醇梯度洗脱,得到16个流份。第10个流份析出沉淀13.5 g,经Sephadex LH-20柱色谱纯化、HPLC制备后得一单体化合物(纯度99%),通过NMR、IR等波谱学方法鉴定产物为淫羊藿苷(C33H40O15),其结构见Fig 1。 1.1.3 pcr检测产物 仪器: OLYMPUS显微镜(日本),PCR扩增仪(Gene Amp PCR System 2400,美国),美国MIS-2000 SP型3Y显微图像分析仪,3 Y分析软件(Pro,Ver,4.0)。试剂:17β- 雌二醇(17β- E2,Sigma),RT反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和TRIzol总RNA提取试剂盒均为MBI公司产品。琼脂糖为上海博亚生物工程公司产品,ERβ mRNA原位杂交试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)。 PCR引物由上海博亚生物工程公司合成,ERβ引物序列:上游5′-TCA CCG TCG AGC CTT AGT TC -3′,下游5′-TCT GCA TAG AGG AGC GAT GA-3′,扩增片段长度为286 bp。内参GAPDH引物序列:上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC- 3′,下游5′-TCC ACC ACC CTG CTG TA-3′,扩增片段长度为450 bp。 1.2 方法 1.2.1 组织病理学检测 大鼠按清洁级标准,适应性喂养1 周后,用本实验室建立的背驮式切除双侧卵巢方法造成骨质疏松动物模型:腹腔注射1%戊巴比妥钠 (40 mg· kg-1BW)麻醉后,切除双侧卵巢,余12只做相同的手术操作,背部切口,找到卵巢后,只切除少量脂肪组织后缝合,但不切除卵巢,作为假手术组(Sham)。将切除卵巢的大鼠随机分为 4 组:去卵巢模型组,淫羊藿苷治疗小、中、大剂量组:分别给予25、50、100 mg·kg-1ICA混悬液。模型组和Sham组:灌胃给予等体积蒸馏水,每周测体重1次,每组12只,切除双侧卵巢术后1周,开始给药,持续给药4个月,颈动脉取血处死动物,分离血清,取椎骨、胫骨、下丘脑、子宫(称湿重)等标本检测。 1.2.2 样品的收集和检测 1.2.2. 1.血清激素测试 采用放射免疫法(RIA法)检测雌二醇(E2),放免分析试剂盒由中国医学科学院核医学技术中心提供,操作步骤按说明书进行。 1.2.2. 骨密度的测定 取椎骨(L3),剔除肌肉及筋膜,生理盐水冲洗,用美国Lunar公司双能X线骨密度仪及其所附的“The Small Subject Scan”小动物测定软件测量。 1.2.2. 灌流液及多聚甲醛磷酸盐缓冲液注意事项 用10%水合氯醛麻醉动物(3 ml·kg-1BW),腹面朝上,四肢固定在木板上,剪开胸腔,将右心房及左心室尖剪开,用乳胶管从左心室尖插入心室并从左房室孔进入主动脉,