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电针对大鼠下丘脑室旁核区单胺类递质的影响 经络与肠道的关系是经络理论的核心。我们于21世纪初应用基因芯片技术研究了针刺心经、肺经、小肠经干预急性心肌缺血模型大鼠的下丘脑差异表达基因,结果发现大量的单胺类相关基因发生了差异性的表达,基于此我们提出了经脉脏腑相关与脑联系的研究是中西医学理论结合的突破口,进一步从下丘脑的单胺类神经递质含量的角度研究针刺不同经穴的相对特异性物质基础。 研究表明,下丘脑可通过对自主神经功能、血管加压素合成和释放、压力感受器反射等的调控来调节心血管功能活动。其中诸多神经递质均可通过改变自主神经活动引起心血管反应。本研究通过观察电针手厥阴心包经络穴“内关”、手少阴心经原穴“神门”、手太阴肺经原穴“太渊”对心肌缺血模型大鼠下丘脑室旁核区单胺类递质含量的影响,探究下丘脑在针刺抗心肌缺血过程中的作用机制及其物质基础,研究经脉脏腑相关与脑联系的中枢调控机制,以及电针不同经穴效应相对特异性的中枢物质基础。 1 材料和方法 1.1 动物分组及饲养 普通级健康成年SD大鼠80只,雌雄各半,体质量(200±20)g,由南京安立默实验动物有限公司提供。室温环境下普食喂养1周。按照随机数字表随机选择10只大鼠作为正常对照组(简称正常组),其余大鼠进行模型复制。将模型复制成功的大鼠随机分为模型对照组(简称模型组)、电针神门组(简称神门组)、电针内关组(简称内关组)、电针太渊组(简称太渊组),每组10只,剩余模型大鼠同等条件下饲养备用。存在心电图异常、实验手术或记录失败、麻醉过量死亡、机能状态不良或术中死亡者未列为实验分析对象。对动物的处置遵守我国科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。 1.2 仪器、试剂和仪器 去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)酶联免疫检测试剂盒(RB公司)。Powerlab 16导生理记录仪(澳大利亚AD instruments公司);PCE-A型程控电针治疗仪(安徽天恒科技实业有限公司);ALLEGRA 64 R冷冻离心机(美国BECKMAN公司);ELX 800 UV酶标仪(美国BIOTEK公司);针灸针(苏州医疗用品厂)。 1.3 心肌缺血模型的建立 模型复制前记录正常心电图,心电异常者剔除不用。参考本实验室对大鼠心肌缺血模型的改良方法进行模型复制。大鼠乙醚麻醉后固定于手术台上,左胸部备皮,常规消毒。沿胸骨左缘剪开皮肤,用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌,暴露左侧第2、3、4肋,以便清晰地观察到心脏暗影,用弯头止血钳沿胸骨左缘3、4肋间撑开肋骨,挤出心脏,充分暴露心脏及其表面的血管,用4/0医用缝合线在冠状动脉左前降支下1/3处快速结扎,心脏复位后立刻关闭胸腔。根据模型复制前后心电图变化情况及眶下静脉血血清酶学指标肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的改变评判心肌缺血模型复制成功与否。心肌血清酶学指标检测采用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统,利用比色法测定吸光度,严格按说明书要求进行,使用全自动生化分析仪测定CK、LDH活性。 1.4 针内推流式电针仪 分别消毒各电针组大鼠左侧“内关”“神门”和“太渊”穴区,用不锈钢28号13 mm长毫针直刺入穴位,针柄连接PCE-A型程控电针治疗仪输出端,参考电极置于穴区沿经脉纵向近端约2 mm处,接电针仪的另一输出端。刺激电压5 V,电流强度1.1 mA,频率为2 Hz,波宽300 ms,正负向交替方波刺激,每次刺激10 min,造模后第3天开始针刺治疗,1次/d,电针3 d。模型组大鼠只固定不电针。 1.5 动物脑剖面准备 针刺治疗结束后在大鼠麻醉状态下活体取材,距第1次针刺时间50 h左右。用10%水合氯醛(1 mL/kg)腹腔麻醉所有大鼠,开颅取出完整脑组织,参照Paxinos和Watson大鼠脑解剖图谱,在冰上用无菌刀片切取下丘脑室旁核区2 mm×2 mm×2 mm脑组织(经病理证实此脑区包含室旁核),称重后立即标记置于3 mL冻存管,液氮冷藏保存,每只动物取材时间不超过2 min。采用酶联免疫法检测NE、DA和5-HT的含量。 1.6 数据分析工具 统计数据结果均用均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。各组间均数比较采用单因素方差分析,组间均数的两两比较采用最小显著法(LSD),P0.05为差异有统计学意义的标准。 2 结果 2.1 大鼠心电图结果 通过标准Ⅱ导联心电图和血清CK、LDH活性改变判断心肌缺血动物模型复制是否成功。与正常组大鼠心电图相比,造模后大鼠心电图出现了明显改变,可见T波倒置,J点抬高(见图1);由图2可知,模型大鼠血清CK和LDH较正常大鼠显著升高(P0.01)。提示心肌缺血动物模型