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侧脑室注射urocorin对大鼠脑区fos表达的影响 0 ucn对大鼠fos的作用 urocortin（rcn）是促进肾上腺皮质激素释放因素（crf）家族蛋白（主要包括crf、rcn、rcnii和rcn）的新成员。2001年，lewis从大鼠的大脑中克隆出来。它可以特定地结合起来的2ccrf2r（crf2r）。mcn免疫反应的阳性神经纤维在中枢神经系统中广泛分布，并与crf2r分布重叠。结果表明，mcn是crf2r的内源性配体。然而，rcn在中枢神经系统中的作用和具体位置尚不清楚。因此，使用免疫组织化学方法，观察角室注射mcn对大鼠喂食相关脑区域和crf2r分布区域的影响，并观察这些部位的分布是否与crf2r的分布一致，为进一步探索rcn在中枢神经系统中的生理作用提供了学术依据。 1 材料和方法 1.1 实验动物及抗体 成年健康雌性SD大鼠10只,体质量220～250 g,自由摄食、饮水,动物房温度维持在(20±3)℃,光暗周期为12 h∶12 h,实验前在上述条件下喂养2 d. UcnⅢ 购自美国Sigma公司;一抗为多克隆兔抗c-Fos 抗体(Sc-52),购自美国Santa Cruz 公司;SP试剂盒(羊抗兔)及DAB浓缩型试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司. 主要仪器有显微镜(Olympus,BX51)、照相机(Spot Insight,U3.5)、图像分析软件(Image - Pro Plus). 1.2 方法 1.2.1 动物的诱导表达 将动物ip 100 g/L水合氯醛(40 mg/kg)麻醉后,固定于大鼠脑立体定位仪上,调节定位仪使动物头部左右对称,前后囟处于同一水平面上. 沿颅顶正中剪开头皮暴露颅骨,根据Paxinos Wastson大鼠脑图谱确定侧脑室(前囟后1.0 mm,向右旁开1.5 mm,硬脑膜下3.0 mm)位置. 用微型电钻在此位置上方颅骨相应部位开一小孔(孔径约2 mm),将一不锈钢套管(直径约0.9 mm)置于脑室内. 另外,在颅骨上植入3个不锈钢小螺丝(直径约1.8 mm),用牙科水泥将套管和小螺丝一并固定于颅骨上,用一不锈钢管心针插入套管内,防止套管堵塞. 手术后大鼠单笼饲养,至少恢复7 d. 恢复期间,每日早上给予适应性注射以减少应激导致的Fos表达,实验前3 d将每日体质量增加少于6 g的动物排除实验. 实验当日将动物随机分为2组,每组5只,用微量注射器抽取5 μL生理盐水或UcnⅢ(25 μg),将针头插入套管下1.0 mm处缓慢推入侧脑室,注射后将动物放回笼内. 2 h后,ip乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉,打开胸腔,经左心室-主动脉插管,100 mL生理盐水迅速灌注冲洗血液,40 g/L多聚甲醛固定液(0.1 mol/L PB配制,pH 7.4)400 mL灌流约90 min. 断颅取脑,置入固定液,4℃下保存4～6 h,再转入200 g/L蔗糖溶液(0.1 mol/L PB配制,pH 7.4)4℃过夜. 做冰冻冠状切片,片厚40 μm,收集于PBS中. 1.2.2 免疫组化监测fos抗体 采用SP免疫组织化学染色,洗脑片(PBS 0.01 mol/L). 3 mL/L H2O2孵育30 min. 洗片(5 min×3),3 mL/L Trition X-100室温孵育40 min;洗片.正常山羊血清封闭,室温60 min;兔抗鼠Fos抗体(1∶500,Santa Cruz)孵育脑片,4℃下孵育48 h. 洗片;生物素标记羊抗兔IgG室温孵育1 h,洗片.S-A/HRP室温孵育1 h,洗片, DAB显色10 min;PBS 冲洗终止反应,裱片、脱水、透明、封片. 1.2.3 改变图像分析规则 共选取13个中枢核团或亚核进行分析,其中包括CRF2R分布较多的部位以及对摄食及味觉有重要调控作用的核团. 对每只动物同一脑区的Fos阳性细胞记数时必须选择在相同平面,每只动物选择两张脑片,用IPP软件在光镜下进行图像分析,图形规则的核团在指定直径的圆内记数,图形不规则的核团用手动功能在特定的范围记数,两侧的平均值作为该核团内特定范围的单侧Fos阳性细胞数. 统计学处理: 所得数据建库,应用SPSS 10.0软件进行统计学处理,结果以xˉ±sxˉxˉ±sxˉ表示,组间比较采用成组t检验. 2 fos免疫反应阳性细胞表达 共检测了13个部位Fos阳性细胞的表达(Tab1). 与对照组相比,侧脑室注射25μg UcnⅢ后,可诱导前脑及后脑相关脑区的Fos表达. 在下丘脑室旁核 (PVN,Fig1A,B)、终纹床核(BST,Fig2A,B)、隔外侧核(LS,Fig3A,B) 、臂旁核(PBN)及最后区(AP)均有大量Fos免疫反应阳性细胞表达;另外,UcnⅢ还诱导杏仁中央核(CeA)、弓状核