膜片钳技术原理与基本操作.docxVIP

1976年Neher和Sakmann成立了膜片钳技术（Patchclamptechnique），这是一种以记录经过离子通道的离子电流来反应细胞膜上单调的或多半的离子 通道分子活动的技术。1981年Hamill,Neher等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改良，形成了现在宽泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于很多细胞系的研究，也是当前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基来源理 用一个尖端直径在~μm的玻璃微电极接触细胞膜表面，经过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小地区（膜片，patch）与其周围在电学上分开，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设施有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极 拉制器、三轴液压显微操纵器、障蔽防震实验台、恒温标本浇灌槽、玻璃微电极 研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的重点设施，拥有高敏捷 度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是经过单根电极对细胞或膜片 进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以 运算放大器和反应电阻组成的电流-电压（I-V）变换器，运算放大器作为电压控 制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 膜片钳微电极制作 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃种类，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串连电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记 录时多项选择用。玻璃毛细管的直径应切合电极支架的规格，一般外部直径在~。内径1mm。 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在 1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可获得所需要的电极尖端直径。电极必须保持洁净，应现用现拉制。 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了战胜热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它拥有疏水性、与玻璃交融亲密、非导电性的特性。涂完硅酮树酯的玻璃微电极须经过加热的镍铬电阻线圈烘干变固，以 防硅酮树酯顺着电极流向尖端而影响千兆封接。烘干后才能进行热磨光。 热磨光(heatpolish)：一般在玻璃研磨器下对电极尖端进行热磨光，磨光后可使电极尖平滑并烧去过多的硅酮树酯薄膜，有利于千兆封接的形成。当前大部分实验室在作全细胞模式记录时，不涂硅酮树酯也不进行热磨光，也可形成很好的千兆封接。 电极液的充灌：当前最常应用的是用注射器反向充灌。用细长的注射器针头 或拉细的聚乙烯胶管从电极尾端插入到电极尖端，再进行灌输。灌输后电极尖端有少许气泡，清除气泡的方法是用左手拿住电极，尖端向下，用右手轻轻弹击电极，可见气泡徐徐上涨直至清除。电极液不要充灌太满，能与探头的银丝接触上即可，溶液过多会浸入探头支持架致使潮湿而影响实验记录。 溶液的组成 (1)电极液：根据记录的电流不同电极液的成分也不同。基本要求是等张的KCI 溶液，Ca2+浓度为10~100nmol(pCa7~8)，pH值7~。这里介绍一个在全细胞记 录模式时，经过改变保持电位，能分别记录到Na+、K+、Ca2+电流的电极液成分 (mmol/L)：KAspartic，KCI，KH2PO425，HEPES，EGTA，KOH，MgCl21， ++2+ CaCl2，ATPNa2。用KOH调pH至。如果要记录纯的Na、K、Ca电流，则需 要使用相应的工具药。 HEPES（N-2-hydroxyethyopiperazine-  N’-2-ethanesulfonicacid  ，羟乙基哌 嗪乙烷磺酸） 细胞外液（浴槽液）：分别细胞和记录电流时应用。分别神经细胞主要用人 工脑脊液（artificialcerebrospinalfluidsolution，ACSF），成分（mmol/L）： NaCl124，KCl，NaH2PO4，MgSO4，CaCl22，NaHCO326，glucose10。该液体需要通以95%O2＋5%CO2混淆气体。如果用HEPES作缓冲系，则ACSF的成分如下 mmol/L）：NaCl140，KCl，MgCl21，CaCl21，glucose25，HEPES10。 上述溶液的配制均使用去离子水。 神经细胞的分别 运用膜片钳