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低分子肝素抗凝活性研究进展 1916年，摩尔发现了良好的抗凝效果，并在半个多世纪内被广泛使用。它是一种重要的生化药物，广泛用于医药临床应用。肝素不仅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等多种生物功能,同时也是一种防治深部静脉血栓、肺栓塞或其它血栓的有效药物。但是肝素在临床应用时常伴有出血、血小板减少,骨质疏松等副作用,有时甚至可引起致死性颅内出血,据报道出血率高达35%。但到目前为止,尚无一种能够完全替代它的产品,尽管存在以上副作用,但在临床上它仍然是预防手术后血栓形成和治疗急性静脉血栓的首选药物。为了减轻肝素的副作用,人们采取了各种方法,如局部用药或小剂量用药,或将肝素钠盐转为肝素钙盐等,都分别收到较好的效果。1976年Johnson等发现当皮下注射从肝素中分离出来的分子量较小的片段(即低分子肝素,简称LMWH)时,在人体内其抗活性X因子(FXa)的作用远高于普通肝素(SH),而出血副作用却明显降低,其报道立即引起人们的广泛兴趣与密切关注。80年代以后低分子肝素以其抗血栓作用强、出血副作用小,半衰期长、生物利用率高等优异的药用物性,成为了当今肝素研究的热点,发展十分迅速。目前国外已有十多种LMWH产品相继问世,我国自90年代起亦开始了低分子肝素产品的研制。 1 抗凝活性通过糖链活动的方式来激活 肝素是分子量大小各异的一簇酸性粘多糖混合物的统称,具有由六糖或八糖重复单位构成的线形链状分子,分子量从3到37kD之间,平均分子量15kD。而低分子肝素则是由肝素化学降解或经分级分离或通过遗传工程或化学方法合成得到的低分子量的肝素片段,分子量3～8kD,平均分子量5kD左右,约为母体肝素分子量的1/3,结构较为单一。与肝素相似,低分子肝素是由D-葡糖胺与葡糖醛酸或艾杜糖醛酸交替残基糖链组成。近年来的研究发现,肝素的抗凝活性是通过在肝素糖链中存在着一种独特的五糖单位活化抗凝血酶来发挥作用和进行传递的。这种五糖单位沿肝素糖链随机分布,在普通肝素中约占1/3,而在低分子肝素中仅占15%～25%。五糖与抗凝血酶结合可导致抗凝血酶构象发生改变,使其与凝血酶及其激活因子FXa相互作用加速1000倍以上。而低分子肝素和普通肝素的主要区别就在于它们与FXa因子及凝血酶的相互抑制作用不同。含五糖的低分子肝素与抗凝血酶直接结合,引起抗凝血酶构象的改变,从而抑制FXa因子的活性。普通肝素必须与凝血酶和抗凝血酶相结合,形成三元复合物才能有效地灭活凝血酶。这种复合物只能通过至少由18个糖基组成的含五糖单元的肝素链组成,当分子糖链少于18糖基序列,就不能同时有效地与前二者结合形成复合物,发挥不了抗凝作用。而对FXa因子的灭活不需要与肝素和ATⅢ和FⅡa形成复合物,而是通过HS结合ATⅢ后进行的,不需要具备18糖基链。在低分子肝素中由于糖链缩短,仅有25%～50%的LMWH分子含有18个糖基链,五糖单元明显低于普通肝素,与FⅡa结合的能力减弱,但与ATⅢ的亲和力增强,而且小分子糖链仍保持对FXa因子的活性…,从而导致出一些不同于普通肝素的性质,如抗凝作用强、生物利用度高等(表1)。夏小平等将低分子肝素应用于白内障囊外摘除及人工晶体植入术中发现低分子肝素比普通肝素具有更强的纤维蛋白溶解作用,而引起出血的危险性仅为后者的1/33。 2 低分子激素产品的分子量和生物功能 目前对低分子肝素的制备已有多种方法,制备方法不同,所得到的低分子肝素产品的分子量和生物功能也有所不同。但从机理上讲,制备方法大体上可分为3种类型:即物理分离法、化学裂解法和合成法。值得注意的是,这些方法多采用专利保护的形式来进行生产。 2.1 低分子激素的合成 主要方法有:有机溶剂沉淀法(如乙醇分级沉淀法)、凝胶过滤法、亲和层析法、离子交换层析法和超滤法,其中以亲和层析最为重要。物理分离法制备的低分子肝素大多用于结构测定及生物活性的研究,目前尚未见到大批量生产的报道。但该法可以用商品肝素作为原料进行分离得到的低分子组成或是结合应用于化学裂解法产物的分离、纯化等。 2.2 低分子激素的生物活性 又分化学裂解法和酶化学裂解法,主要有:亚硝酸控制解聚降解法、过氧化物降解法、B-消除降解法、自由基催化降解法、肝素酶降解法、苯甲基化并碱降解法和高磺酸氧化降解法等。然而,无论是采用哪种降解法都会改变肝素的结构,而有的降解反应恰巧在抗血栓的活性位点上,从而影响了它的抗栓活性。不同的降解反应所得的产品的末端结构不同,亚硝酸降解,产物的末端为脱水甘露糖或甘露醇;肝素酶或B-消除降解的产物在非还原末端含有N-硫酸葡糖胺;而采用自由基催化降解法,其产物末端则多为N-硫酸葡糖胺和艾杜糖醛酸…。由于末端结构不同,导致其生物功能也不尽相同。例如:将制取肝素的副产品-低抗凝肝素溶解在醋酸溶液中,加入亚硝酸钠溶液,在室温下