荧光原位杂交实验方法的探讨.docxVIP

荧光原位杂交实验方法的探讨 1969年，pardue和john两个研究小组建立了原始杂交技术（ish）。该技术可以在保持细胞形态完整性的情况下检测特定的碱原子序列，即使用dna或rna检测，并通过原始混合方法显示特定的dna或nip序列。首先，采用了一种相位标记法，通过辐射自响应指示结合目标位置的检测。在此基础上，改进了标记材料，使用了荧光酶、地高辛、生物素等荧光材料，形成了原荧光混合技术（fish）。荧光材料的使用提高了分辨率，简化了检测过程，提高了安全性，同时可以进行不同的检测，发展出了多个原位杂交，并广泛传播。1988年，giovannoni等人首次将fish技术引入细菌学研究。1989年，dale首次通过荧光标记遗颗粒酸探针检测单个微生物细胞。近年来，该算法已成为医学、生态、遗传、环境微生物的有力工具。 1 fish技术在微生物系统发育中的应用 FISH是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而形成的新技术.其原理是基于碱基互补的原则,用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针,与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交,与待测核酸的靶序列专一性结合,通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位.目前,荧光原位杂交在微生物系统发育、微生物诊断和环境微生物生态学研究中应用较多.由于微生物的16S rDNA、23S rDNA以及它们的间隔区的核苷酸序列具有稳定的种属特异性,通常以它们特定的核苷酸序列为模板,设计互补的寡核苷酸探针,通过与微生物细胞杂交,鉴定微生物的种类、数目以及空间分布等.利用对rRNA(主要是16S和23S rRNA)序列专一的探针进行杂交已经成为微生物鉴定的标准方法.近几年,已对2500多种细菌的16S rRNA进行了测序,在系统发育水平上得到了大量的有用信息. FISH技术的基本操作过程对染色体、细胞和组织切片来说基本相同,主要包括4个步骤:1)制备和标记探针;2)准备杂交样品;3)原位杂交;4)信号处理及观察记录.根据不同的实验目的和研究对象,每一步骤的要求和细节会有所变化.对于微生物FISH实验而言,解决好如下关键步骤的技术问题是获得科学结果的保证. 2 fish实验的重要步骤和方法 2.1 寡核苷酸探针的设计与合成 核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,而后又能被特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链.根据来源和性质可将核酸分子探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针以及人工合成的寡核苷酸探针几类.可以针对不同的研究目的选用不同的核酸探针,选择的基本原则是探针应具有高度特异性. 核酸探针的制备是FISH技术关键的一步,影响着该技术的应用与发展.近年来,随着DNA合成技术的发展,可以根据需要随心所欲地合成相应的核酸序列,因此,人工合成寡核苷酸探针被广泛采用.这种探针与天然核酸探针相比具有特异性高、容易获得、杂交迅速、成本低廉等优点. 寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的.一般应遵循如下的设计原则:1)探针长度:10～50 bp.越短则特异性越差,太长则延长杂交时间.2)G+C%应在40%～60%,否则降低特异性.3)探针不要有内部互补序列,以免形成“发夹”结构.4)避免同一碱基连续重复出现.5)与非靶序列区域同源性70%.目前,已有大量寡核苷酸探针被设计合成,并且建立了有关探针的数据库,研究者可以很方便地通过互联网查询所需的探针或设计探针的资料和软件.例如,Loy A.,Horn M.,Wanger M.等建立的probeBase寡核苷酸数据库,就可以提供以rRNA为目标的寡核苷酸探针的相关资料以及检验探针专一性的软件系统.常用于环境微生物检测的寡核苷酸探针见表1. 设计或选定的寡核苷酸探针可以用DNA合成仪很方便地合成,然后用荧光素进行标记.常用的荧光素有:异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)、四甲 6羧罗丹明(TAMRA)、吲哚二羧菁(Cy3,Cy5)等.这些荧光素具有不同的激发和吸收波长,一般需要选择两种以上的探针同时杂交时,要给这几种探针分别标记不同的荧光素.标记的方法分为间接标记和直接标记.目前,有人在多彩色荧光原位杂交实验中,采用混合调色法和比例调色法,仅用2～3种荧光素就可以给4～7种探针标记上不同的颜色.探针的合成与标记可以根据条件自己进行或选择相应的生物技术公司来完成.标记好的探针通常放在-20 ℃、避光保存.使用前,将探针稀释到5 ng/mL的质量浓度,分装备用. 2.2 微生物细胞的分离和纯化 对于微生物原位杂交,首先涉及的是微生物样品的收集.既要求尽可能多地收集到样品中的微生物,又要尽量减少样品中杂质对杂交结果的影响.因此,无论是来自人工培养基的,或是自然环境的,还是污水处理设备的微生