五味子醇提取物逆转肿瘤多药耐药的血清药理学研究.docxVIP

五味子醇提取物逆转肿瘤多药耐药的血清药理学研究 肿瘤化疗的最大障碍之一是肿瘤细胞对肿瘤药物产生的多药物耐药性（mdr）。MDR是指肿瘤细胞接触了某些抗癌药物后产生了对这些抗癌药物以及其他多种未接触过的、结构和作用机理完全不同的抗癌药物的耐药性。容易引起肿瘤细胞MDR的药物多为天然的相对分子质量较大的亲脂性药物, 例如蒽环类:阿霉素、柔红霉素等;长春花碱类:长春新碱;鬼臼类:鬼臼乙叉苷、鬼臼噻吩苷;紫杉烷类:紫杉醇等。MDR产生的机制十分复杂, 而且是多因素的。经典的耐药机制涉及到ABC (ATP Binding Cassette) 型膜载体蛋白家族, 其中以多药耐药糖蛋白 (Permeability glycoprotein, P-gp) 最具代表性。由P-gp介导的MDR是目前研究的最为广泛和深入并在临床实践中得到证实的耐药机制。 逆转肿瘤细胞的MDR从而使其恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床意义。国外对MDR逆转剂也称调节剂已进行了大量研究, 包括1981年发现的以维拉帕米为代表的第一代MDR逆转剂, 以PSC 833为代表的第二代MDR逆转剂, 及克服了第一代、第二代逆转剂毒副反应大、与其他药物合用存在药动学相互影响问题的第三代MDR调节剂, 目前一些第三代逆转剂如美国礼来公司开发的LY335979正在进行临床试验。 国内开展肿瘤MDR研究较晚, 临床有效的逆转剂还是一项空白。五味子是常用中药, 具收敛固涩, 益气生津, 补肾宁心之功效, 药用价值很高。我们以前的研究发现五味子果仁醇提取物 (Fructus Shisandrae, FS) 及其有效单体五味子甲素 (Schisandrin A) 具有逆转肿瘤多药耐药的活性, 能够大大提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本实验在前期研究的基础上, 制备大鼠含药血清, 利用血清药理学进一步观察含五味子果仁醇提取物血清逆转肿瘤MDR的作用及其作用机制, 为开发五味子果仁醇提取物作为肿瘤MDR逆转剂应用于临床的潜能提供更扎实的基础。 材料和方法 1 材料表面 1.1 特效药 五味子果仁醇提取物, 黑膏状, 动物给药用2% Tween80助溶, 蒸馏水配制。 1.2 动物 SD大鼠, 体重200～250g, 购自中国医学科学院医学实验动物繁育场, 饲养于GLP动物饲养室。 1.3 细胞、实验和培养条件 人口腔上皮癌细胞株KB细胞及其长春新碱 (vincristine, VCR) 耐药株KBv200细胞, 人肝癌细胞株Bel7402细胞由中国医学科学院药物研究所药理室肿瘤组惠赠。细胞均在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液 (含青霉素100U·mL-1, 链霉素100μg·mL-1) 中生长, 培养条件为37℃, 5% CO2, 饱和湿度。用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA液消化传代。耐药的KBv200细胞在含VCR 200nmol·L-1的培养液中维持其耐药性, 进行实验时至少脱药培养3d。 1.4 药物、药物和抗 RPMI 1640培养基购自Gibco公司。新生小牛血清购自杭州四季青生物工程公司。注射用盐酸阿霉素 (doxorubicin, DOX) 购自深圳万乐药业有限公司。注射用硫酸长春新碱 (VCR) 购自上海华联制药有限公司。P-gp单克隆抗体JSB-1购自Zymed公司。兔抗cPKC-α (C-20) 为Santa Cruz公司产品。RT-PCR反应试剂盒为Promega公司产品。Trizon购自Gibcol公司。二抗均购自北京中杉生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司北京DNA合成部合成。 2 方法 2.1 药液制备药液 SD大鼠雄性15只随机分为两组, 正常动物组和五味子醇提取物给药组。前者每日口服给予2% Tween 80液, 后者每日口服五味子醇提取物400mg·kg-1, qd, 共给药7次, 于末次给药前12h动物禁食, 末次给药后1h股动脉取血。血液室温放置1h, 2000r·min-1, 离心20min, 取血清, 同组动物血清混合, 56℃, 30min灭活补体, 然后在超净台中用22μmol·L-1滤器过滤除菌, 所得无菌血清分装, -20℃保存备用。 2.2 含药血清检测 采用MTT法测定含药血清的细胞毒作用和肿瘤耐药逆转活性。取对数生长期的敏感和耐药肿瘤细胞接种于96孔细胞培养板内, 培养24h后, 加入不同浓度的含药血清及相同浓度的正常大鼠血清 (均用无血清的RPMI 1640培养液配制, 下同) , 每个浓度设3～4个平行孔。继续培养72h, 弃去培养液, 每孔加入0.5mg·mL-1MTT液100μL, 继续培养4h, 弃去MTT液, 每孔加DMSO 150μL, 混合振荡器振荡, 于570nm处测