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大鼠永久性脑缺血模型的三种手术方法比较 中风是世界上的第三百个致命疾病，也是全世界研究的重点。在对人类脑卒中的研究过程中,制作稳定性强、重复性高的大鼠脑缺血模型是十分必要的。由于大鼠脑血管特征与人类比较相似,因此较多的被选用来进行一些临床药物的实验。但是在制作大鼠脑缺血模型的过程中,由于各个实验室的条件及其操作人员的个人因素,致使制作模型的时间较长,而且无法得到一个比较稳定的动物模型,其中动物的术后死亡率及其脑缺血面积的不稳定性始终是困扰着广大实验人员的问题,从而也就无法保障随后实验的顺利进行。本课题组通过数百只大鼠脑缺血模型的制备,总结了一种高效稳定的制作大鼠永久脑缺血模型的方法,在这里介绍如下。 1 材料和方法 1.1 药物、试剂和线栓 SPF级SD雄性大鼠100只,体质量240～260 g,购自北京协和医院动物实验中心【SCXK(京) 2007-0001】。固体水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司,使用前用蒸馏水配成10%的水合氯醛溶液。固体2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自北京化学试剂公司,使用前用蒸馏水配成2%的TTC溶液。线栓采用0.24 mm的强力鱼线,长度为5 cm,一端用加热法烧成球形,避免在栓塞过程中刺破血管壁,将其浸泡至酒精中备用。手术过程均在德国Leica手术显微镜下进行。 1.2 实验动物的关怀 无菌手术在北京协和医学动物实验中心屏障动物实验设施进行【SYXK(京)2005-0008】,并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。饲养室温度控制在20～22℃,明暗光照12 h∶12 h。手术前动物自由饮水和进食,手术按外科无菌原则操作。腹腔内按每100 g体重0.2 mL注射10%水合氯醛麻醉大鼠。动物恒温毯设定温度为37℃,于术中保持动物体温恒定,核心体温通过肛温进行监测。 1.2.1 颈内动脉和颈内动脉分离 颈部正中切口,在左右颌下腺间剪开阔筋膜,在右侧胸锁乳突肌和颈前肌群之间向深部分离,显露深面的颈总动脉(CCA)、向上逐渐分离颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)、甲状腺上动脉起始部、枕动脉起始部。 1.2.2 颈内动脉走行方向深部分离 采用改良的Zea Longa法剥离颈内动脉和颈外动脉分叉处的迷走神经节,顺着颈内动脉走行方向向深部仔细分离,暴露出翼腭动脉及其与颈内动脉的分叉处。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始部(甲状腺上动脉分支之前)、枕动脉和翼腭动脉。用动脉夹夹住颈内动脉段阻止血液返流。 1.2.3 线栓的预防 大体步骤同1组,但是暴露枕动脉和翼腭动脉后并不结扎,在送入线栓的过程中,可以在显微镜直视下将线栓越过翼腭动脉开口处而送入颈内动脉。颈内动脉在插入线栓前,用一丝线将其悬挂而并非用动脉夹阻断。 1.2.4 彩插线栓的使线栓进入保护域 大体步骤同1组,但是不暴露翼腭动脉,颈内动脉通过悬挂丝线的方式将其阻断。线栓插入通过盲插的方式,但是在线栓进入0.5 cm的时候,应往下轻压线栓使其远端稍稍翘起,从而避开翼腭动脉的开口处(如图1、2所示,图2见彩插2。),使线栓顺利的进入颈内动脉。三组大鼠均在颈总动脉距离分叉处5 mm处,用显微剪刀剪开动脉壁,送入线栓约1.8 cm,结扎固定线栓。 1.3 综合评价 大鼠脑缺血24 h后采用改良的NSS评分量表对其进行盲评,共18分,分数越高说明大鼠神经功能缺失越重。9～12分表示造模成功。 1.4 脑缺血面积的测定 大鼠脑缺血24 h后,深麻醉断头取脑,-80℃冷冻后行冠状切片,从额极至中脑依次切成6块,每块平均厚度为2 mm。将切片迅速浸入2%的TTC溶液中,37℃孵育30 min,孵育过程中每隔5 min将切片翻转一次,保持染色均匀。染色后将脑片浸泡在0.01 mmol/L的PBS溶液中,用数码相机采集图片,然后用Image J软件对脑缺血的面积进行计算。为了避免因为脑水肿引起的误差,采取下面的计算公式:右半球梗死面积=左半球脑面积-(右半球脑面积-右半球梗死面积)。 1.5 灌胃水辅助治疗 将造模术后评分为10分的脑缺血大鼠随机分为2组,分别在第1天和第3天给予10%的葡萄糖生理盐水灌胃每只2 mL和腹部皮下注射每只1 mL,连续给3 d,观察术后辅助治疗对大鼠的存活及体重恢复的影响。 1.6 均数的确定sxs 全部资料通过SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。各组数据均以xˉ±sxˉ±s表示。采用单向方差分析(One-way ANOVA)方法中的Bonferroni法进行各组均数的多重比较(post hoc multiple comparisons)。P0.05认为统计学差异具有显著性意义。 2 结果 2.1 组大鼠死亡率比较 术后24 h观察脑缺血大鼠的存活情况。从表1中我们可以看到在术后24 h,第3组的大鼠均存活,存活率为