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石榴皮鞣质对肾纤维化大鼠肾功能的影响 石榴是科植物的一种干燥的果皮。它含有酸、涩、性和营养。它是通过普通话谱法保存下来的。石榴皮含有丰富的鞣质、黄酮、生物碱等多种化学成分, 其中以鞣质的量最为丰富, 其量高达10.4%~21.3%, 主要包括没食子酸、鞣花酸、安石榴林、安石榴苷等。近年来的研究显示, 石榴皮鞣质具有抗病毒、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化以及预防心血管疾病等多种药理活性。我国石榴资源丰富, 石榴皮廉价易得, 具有巨大的潜在开发应用价值。本课题组前期研究发现石榴皮鞣质对腺嘌呤性慢性肾衰大鼠和阿霉素肾病大鼠具有保护作用, 具有改善慢性肾脏疾病的作用。本实验以肾纤维化大鼠为研究对象, 探究石榴皮鞣质对肾纤维化大鼠肾功能的改善作用, 为肾纤维化的治疗及石榴皮鞣质的开发利用提供相关的理论依据。 1 材料表面 1.1 果皮、公药酶 石榴皮购于西安中药材市场, 经武汉大学药学院张洪教授鉴定为石榴科 (Punicaceae) 石榴属Punica L.植物石榴Punica granatum L.的果皮, 符合《中国药典》2010年版规定。没食子酸对照品 (批号110831-2200303, 中国食品药品检定研究院) , 干酪素 (批 上海伯奥生物科技公司) , 青霉素 (批号C1210701, 华北制药股份有限公司) , 蒸馏水自制, 丙酮 (分析纯) 、酒精、二甲苯 (国药集团) , 叠氮化钠 (NaN3, 批号201012051457, 谷歌生物有限公司) , 缬沙坦胶囊 (批号130109, 北京诺华制药有限公司) 。其余试剂均为分析纯。 1.2 动物使用熔剂scxk 雄性SPF级SD大鼠, 体质量150~200 g, 由武汉大学动物实验中心提供, 动物使用合格证号:SCXK (鄂) 2008-0004。 1.3 仪器、试剂与仪器 AG245型电子分析天平 (瑞士Mettler) , UV—2800紫外可见分光光度计[尤尼柯 (上海) 仪器有限公司], KD—BM包埋机 (浙江省金华市科迪仪器设备有限公司) , JB—L5冻台 (武汉俊杰电子有限公司) , RM2016切片机 (上海徕卡仪器有限公司) , YXJ—1离心机 (深圳天南海北实业有限公司) , KD—P摊片机 (浙江省金华市科迪仪器设备有限公司) , 7170A型日立生化自动分析仪 (日本东亚公司) , ALPHAI—4/RZ—2冷冻干燥机 (德国Martin Christ) , CK2型倒置显微镜 (日本Olympus公司) 。 2 方法 2.1 滤取滤液、滤液 称取干燥石榴皮约100 g, 粉碎。室温下, 用10倍量70%的丙酮浸渍约6 h, 后超声30 min, 滤取滤液。其残渣重复以上操作2次, 合并滤液并浓缩。浓缩液上HP-20柱, 以70%乙醇洗脱, 收集洗脱液, 浓缩、冷冻干燥, 即得石榴皮鞣质粉末。按《中国药典》2010年版中鞣质定量测定方法对石榴皮中鞣质的量进行测定, 石榴皮鞣质粉末中含鞣质55.62%。 2.2 实验分组及分组 实验所用大鼠共3批, 每批40只。将40只雄性SD大鼠常规喂养1周以适应实验环境后, 随机分为5组, 即假手术组、模型组、缬沙坦阳性对照组、石榴皮鞣质低剂量组 (20 mg/kg, 以鞣质的量计) 、石榴皮鞣质高剂量组 (60 mg/kg) , 每组8只。 2.3 模型大鼠的造模手术 参照文献报道采用左侧输尿管结扎方法构建大鼠肾纤维化模型。先以5%水合氯醛 (按6mL/kg计算) ip麻醉大鼠, 常规消毒。无菌条件下, 沿腹正中打开腹腔, 暴露左侧肾脏并游离左侧输尿管, 用丝线在接近肾盂段, 即中上1/3处, 两侧结扎并从中间剪断输尿管。依次缝合肌肉层和皮肤层, 关闭腹腔。其中假手术组大鼠按相似的操作步骤进行手术, 但仅游离左侧输尿管, 不对其进行结扎和剪断。术后每日ip 1% (1 g/100 mL蒸馏水) 青霉素, 连续3 d, 同时伤口以碘伏消毒, 防止感染。 术后当天开始ig给药, 石榴皮鞣质高、低剂量组, 分别给予60、20 mg/kg溶于蒸馏水的石榴皮鞣质。缬沙坦组按10 mg/kg给予缬沙坦。假手术组与模型组大鼠均给予等量蒸馏水。各组大鼠每天同一时间给药1次, 直至实验结束。 2.4 肾组织病理学检测 于术后1、2、3周分别取一批动物, 将各组8只大鼠分别置于代谢笼中收集24 h尿液, 记录尿量体积, 加入1%NaN3溶液200μL以防腐, -70℃冰箱保存, 用于24 h尿蛋白定量检测和测定尿液中Ca2+、P3+的浓度变化。分别以10%水合氯醛麻醉各组大鼠, 并行心脏采血2~3 mL, 迅速在低温下4 000 r/min, 离心13 min, 分离血清, 送武汉大学人民医院检验科检测尿素氮