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连钱草中熊果酸的高效液相色谱测定法 连草是嘴唇科植物的活血丹glechoma中期干燥的土壤。具有润水、通粘液、清热解毒、祛瘀、消肿等功效。临床应用于热悬液、石雨、湿热黄疸等疾病的治疗。作者对采自贵州省贵阳地区的连钱草进行系统的提取与分离, 发现熊果酸的含量较高。罗启剑等曾用分光光度法测定了连钱草中熊果酸的含量。迄今为止, 尚未见HPLC测定连钱草中的熊果酸含量的报道。因此建立了连钱草中熊果酸的高效液相色谱测定法, 为连钱草的质量控制提供依据。 1 唇形科植物活丹的鉴定 Agilent 1100高效液相色谱仪, Agilent 1100色谱工作站。连钱草样品购于贵阳、凯里地区, 由贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为唇形科植物活血丹G.longituba的干燥地上部分。熊果酸对照品自制, 从连钱草分离纯化得到, 经NMR, IR, MS鉴定为熊果酸, 并用HPLC面积归一化法测定, 其纯度为98.7%。乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。 2 方法和结果 2.1 彩色图像hypersilos4.6mm250mm，5m-色度柱，流动相乙腈-0.15%磷酸水溶液85.15，速度1.0 mL·min-1, 检测波长210 nm, 柱温30 ℃, 进样量10 μL。 2.2 gg 精密称取熊果酸对照品25.32 mg, 置于25 mL量瓶中。甲醇溶解并稀释至刻度, 得含熊果酸1.013 mg·mL-1的对照品溶液。 2.3 超声处理液的制备 取连钱草样品粉碎 (过60目) , 105 ℃干燥至恒重, 精密称取1 g样品置于100 mL锥形瓶中, 加入氯仿100 mL, 称重, 超声处理60 min, 用氯仿补至原重。过滤后取续滤液50 mL浓缩至干。残渣用甲醇溶解, 转移至5 mL量瓶中。甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 微膜 (0.45 μm) 过滤即得。色谱图见图1。 2.4 标准工作液的配制 精密移取熊果酸对照品储备液0.5, 1, 2, 3, 4, 5 mL, 分别置于10 mL量瓶中。甲醇稀释至刻度, 配制成一系列浓度的标准工作液。在上述色谱条件进行测定。以峰面积Y对对照品进样量X(μg) 进行线性回归, 得熊果酸回归方程Y=644.68X-13.08,r=0.999 9, 表明熊果酸的进样量在0.51~10.13 μg线性良好。 2.5 稳定性测定 取同一样品溶液, 室温下放置, 分别在0, 2, 4, 6, 8, 12 h 进行测定, 峰面积的RSD为0.64%, 表明样品溶液在12 h 内稳定。 2.6 精密度测试 精密吸取同一对照品溶液进样, 每次10 μL, 重复进样5次, 峰面积RSD为0.13%, 表明测定的精密度较好。 2.7 重复性试验 精密称取同一批次的连钱草5份, 按2.3项制备供试品溶液, 分别进样10 μL, 测定峰面积计算熊果酸的质量分数, 结果为1.62 mg·g-1, RSD为1.0%, 表明方法的重复性良好。 2.8 熊羧酸对照品溶液制备 精密称取已知含量的同一批次样品5份, 每份样品各0.5 g, 置于5个100 mL锥形瓶中, 精密加入熊果酸对照品溶液1 mL (1.046 mg·mL-1) 。按2.2方法制备供试品溶液5份, 按上述方法测定。结果样品的平均回收率为97.5%, RSD为0.49%。 2.9 对照品与样品的制备 按供试品溶液的制备方法分别制备贵州3个不同地点采收的连钱草供试品溶液, 分别吸取对照品与样品溶液各10 μL, 注入液相色谱仪。以外标法计算熊果酸的含量, 结果贵阳花溪、贵阳乌当、贵州凯里连钱草样品中熊果酸的含量分别为0.16%, 0.25%, 0.32%。 3 讨论 3.1 不同提取方法提取效果的比较 根据熊果酸的溶解性能, 选择氯仿、甲醇、乙醚作为提取溶剂, 比较了3种提取溶剂提取方法 (超声、回流及索氏提取) 和不同提取时间 (0.5, 1.0, 1.5 h) 对提取效果的影响。结果显示采用超声提取方法的提取率最高, 氯仿和甲醇对熊果酸的提取率基本一致。但甲醇提取物中杂质多, 测定时干扰较大。因此选用氯仿作为溶剂, 超声1.0 h为宜。 3.2 测定系统及方法 根据文献调研, 选择了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-缓冲溶液、乙腈-0.15%磷酸水溶液等系统进行测定。结果表明乙腈-0.15%磷酸水溶液系统能使供试品中熊果酸与齐墩果酸基本达到基线分离。 3.3 通过本试验的hplc测量，熊果肉的分离效果和线性关系得到了很好的改善 且消除了异构体齐墩果酸的干扰。本方法简单快速、灵敏度高、重复性好, 可用于含连钱草药材及其制剂的质量控制。