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连钱草愈伤组织培养的研究 连金草是著名的血毒症、金钱草和佛耳草科。这是嘴唇科的一种活血药物。它具有清热解毒、利尿、祛石、驱瘀消肿的功效。它用于治疗尿结石、肝结石、湿热黄疸、跌倒和碰撞损伤等症状。已被《中华人民共和国药典》收录。连钱草茎、叶含挥发油，其有效成分为松樟酮、薄荷酮、异薄荷酮、番薄荷酮等，尚含熊果酸、琥珀酸多种化学成分，但天然植物体内化学成分的含量较低，要提取其化学成分就要大量开采连钱草植株，这对生态平衡有一定破坏作用。随着生物技术的发展，通过植物组织培养方法，可以生产天然的植物成分并提高某些植物成分的含量，如通过对红豆杉(Taxus chinensis(Pilg．)Rehd．)愈伤组织培养，使紫杉醇及三尖杉醇的含量均高于外值体中的含量。目前，对于唇形科药用植物的愈伤组织培养已有一些报道，但有关连钱草愈伤组织培养国内外尚未见公开报道。本研究基于上述研究现状，对连钱草愈伤组织诱导进行初步探索，获得连钱草愈伤组织诱导及增殖的适宜培养条件，为建立大规模细胞培养生产连钱草有效药用成分提供了必要前提条件。 1 材料和方法 1.1 材料表面 愈伤组织培养所用的外植体来自于嘉陵江流域南充段野生连钱草。 1.2 组织损伤的诱导和培养 1.2.1 培养条件优化 于2～6月陆续从母株上取8 cm左右的顶芽、叶、叶柄，自来水冲洗表面杂物，洗洁净溶液浸泡10 min，自来水冲洗20 min，双蒸水清洗外植体后，放入培养皿内，酒精擦拭后放入超净工作台。70%乙醇，浸泡消毒30 s，双蒸水清洗4次。次氯酸钠浸泡1～15 min(视材料的幼嫩程度而定)，放入培养皿中双蒸水清洗数次。剪取顶芽(0.5～1 cm)、叶片(0.5 cm×0.5 cm)、叶柄(0.5 cm)、接种到培养基上。 1.2.2 细胞分裂素ba、kt和4-d的体外培养 选用基本培养基MS和LS，改良后分别添加不同类型和浓度的生长素2,4-D、NAA和细胞分裂素BA、KT,30 g·L-1蔗糖，8 g·L-1琼脂，0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl调节p H为5.8，高压(121℃)灭菌15 min。 1.2.3 诱导过程光照条件 置于HPG-280H人工气候箱内培养，温度为(24±2)℃。诱导过程光照条件分两种处理:24 h暗启动培养后光、暗交替培养(14 h光照，10 h黑暗)，光照强度2 000 lx;全程黑暗培养。 1.3 人工气候箱 在诱导过程中，如发现外植体染菌，则马上将此瓶取出人工气候箱。培养30 d后，将未染菌外植体计算诱导率，计算公式如下: 出愈率(%)=(出愈外植体快数×100)÷(接种数-染菌快数) 1.4 增殖率的测定 先称量继代接种前培养瓶的重量，再称接种后的重量，从而得到接种的愈伤组织重量。培养14 d后，再次进行接种，按同上方法测知14 d后愈伤组织的重量，通过以下公式求增殖率: 接种鲜重(mg/瓶)=接种后瓶重(mg)-接种前瓶重(mg) 收获鲜重(mg/瓶)=收获前瓶重(mg)-收获后瓶重(mg) 增殖率(%)=收获鲜重÷接种鲜重×100% 2 结果与分析 2.1 外植体来源消毒效果 以野外生长和室内盆栽生长一段时间后新生幼叶为外植体，用2%的NaClO溶液各消毒2 min，试验外植体来源不同对消毒效果的影响(表1)。结果表明:在其它条件相同情况下，野生植株的污染较为严重，污染率达45%，而室内盆栽植株污染率仅为16.67%。表1列出了野外和室内栽种外植体来源分别对消毒效果的影响情况。 2.2 ms培养基不同培养条件对连钱草诱导率的影响 基本培养基的类型是愈伤组织诱导的一个重要影响因素，本试验选用MS、LS培养基，分别添加2 mg·L-1的2,4-D调整pH到5.8，经加热溶解后，分装至50 m L三角瓶中，每瓶20 m L,0.15MPa压强下消毒15 min后冷却，在超菌工作台内接种后放置于光、暗交替培养和暗培养。30 d后观察并计算连钱草在两种培养基下出愈率(表2)。 通过试验得知，连钱草在MS培养基光、暗交替条件下诱导率最高(54.23%);在LS暗培养条件下次之(34.43%);在MS培养基暗培养条件下和在LS光、暗交替培养条件下都相对很低。因此，MS培养基在光、暗交替培养条件下对连钱草外植体愈伤组织诱导最为有利。 2.3 植物激素的筛选 2.3.1 不同浓度同生长素对连钱草愈伤组织诱导率的影响 选择MS基本培养基配比以不同浓度的生长素2,4-D和NAA接种外植体于光、暗交替培养，以筛选出最优化的生长素及其对连钱草愈伤组织诱导的最适浓度(表3)。试验表明，不同生长素对连钱草愈伤组织诱导具有显著差异:2,4-D比NAA更适合于连钱草愈伤组织的诱导，在2,4-D与BA(1.0 mg·L-1)组合的培养基上，连钱草愈伤