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连钱草高效液相指纹图谱研究 连草是嘴唇科的一种活血丹[glechomalanovac]的干燥部位，具有湿洗、清热解毒、散瘀、肿胀等功能。近年来,有关连钱草的深入研究受到不少药学工作者的青睐,相继有学者对其所含的三萜酸类、黄酮类等化学成分进行了分离提纯,并建立了三萜酸类(主要为齐墩果酸和熊果酸)及黄酮类(主要为总黄酮、芹菜素和木犀草素)成分的定量分析方法,以此来更好地控制该药材的质量。但中药提取物是多种活性成分的混合体,其药效不是来自单一的活性成分,采用任何单一的活性成分或指标都难以准确地评判中药的真伪和优劣,这种测定单一成分含量的方法并不能全面反映连钱草药材的内在质量。 笔者在本实验中采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)建立了连钱草的色谱指纹图谱,并对不同产地连钱草的指纹图谱进行了比较分析,研究连钱草药材之间差异。 1 试剂和仪器 SHIMADZU高效液相色谱仪(包括LC-20AT梯度二元泵,SPD-20A检测器,日本岛津),金利超声清洗器(上海杰里科技有限公司),DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂),SHZ-ⅲ型循环水真空泵和RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),101-1AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司),METTLER TOLEDO 320 pH计(瑞士)。 芹菜素对照品(南京青泽科技医药科技开发有限公司),甲醇、乙腈(色谱纯,Fisher Scientific),其余试剂均为分析纯,水为超纯水。连钱草药材见表1。除去杂质,自然晾干,粉碎,过内径0.425 mm(40目)筛,使用前60 ℃干燥4 h。 2 方法 2.1 连钱草提取方法 取芹菜素对照品适量,加甲醇溶解并稀释,配制成1 mg·mL-1的对照品溶液。 采用四因素三水平正交设计,包括乙醇用量、提取时间、提取次数和乙醇体积含量。以色谱主要峰面积(单峰面积1%)和各水平极差(R)为评价指标,最终确定的连钱草提取方法为:称取连钱草药材2 g,用80 %乙醇30 mL超声提取30 min,共提取4次。 将连钱草药材粉碎,过筛孔内径0.425 mm(40目)筛,60 ℃干燥4 h。精密称取2 g,用80 %乙醇超声提取4次,每次30 mL,滤过,合并滤液,置旋转蒸发仪减压回收溶剂至干,用80%乙醇转移至25 mL量瓶中,定容,用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过后备用。折合药材浓度为80 mg·mL-1。 2.2 流动相梯度设计 由于中药样品成分复杂,色谱条件较难确定,笔者借助计算机辅助优化软件DryLab[液相资源公司(LC Resources INC.)的计算机模拟软件,用于等度和梯度色谱条件预测]进行优化。以湖北恩施产连钱草提取液为优化对象。流动相选用(A)甲醇(0.5%醋酸,V/V)-(B)水(0.5%醋酸,V/V),初始梯度洗脱程序为:A/B(5/95→95/5,V/V),tG=45 min,最晚流出峰和最早流出峰的时间差△tR与梯度时间tG之比远大于0.4,适于梯度洗脱。仪器的系统滞留体积,(VD)约为3 mL。遵照DryLab软件设计方法,设计优化梯度速率和温度的条件,流动相梯度范围为A/B(5/95→95/5),温度范围为30～50 ℃,如图1所示。 Hypersil ODS2(4.6 mm × 200 mm,5 μm);流动相:甲醇(0.5%醋酸,V/V):水(0.5%醋酸,V/V),梯度洗脱;流速:1 mL·min-1;柱温:40 ℃;检测波长:0→60 min 330 nm,60→90 min 280 nm;进样体积:20 μL。梯度洗脱程序见表2。 3 结果 3.1 指纹图谱的建立及相似度评价 将以上条件下得到的主要峰的保留时间和峰面积,以及滞留体积输入DryLab中,经过色谱峰校对后,得到梯度速率和温度的两因素分辨图,见图2。 如图2所示,梯度时间从50 min延长到90 min,梯度变化速率从1.8%·min-1到1%·min-1(梯度范围/梯度时间)均可增加分离度;而柱温从30 ℃到50 ℃,分离度也得到改善。40 ℃以后,分辨率增加不明显,为延长色谱柱使用寿命,最后确定柱温为40 ℃。 在梯度洗脱过程中,除梯度速率对色谱行为有影响外,梯度范围对于色谱峰在时间轴上的均匀分布及增加柱的峰容量也有显著影响。由于DryLab以4个基本梯度为基础已经构建出模型,对梯度的修改可以直接在软件中进行。最后确定以15 min为分界点,在DryLab中模拟结果如图3所示。以上述条件实际进样分析所得色谱图如图4(A)所示。实验过程中,对梯度分界进行了微调,即以12 min为分界点,前段梯度速率为2.8%,后期梯度速率降低至0.75%·min-