不同毒素对烟草幼苗抗病相关酶系活性及细胞膜透性的影响.docxVIP

不同毒素对烟草幼苗抗病相关酶系活性及细胞膜透性的影响 卷烟是一种重要的耕作。中国种植面积约166.7万公顷。近年来，卷烟病虫害的发生给烟草行业的产量造成了巨大损失，并受到了严重影响。病害种类也逐渐增加,其中烟草镰刀菌(Fusariumsp.)根腐病属于具有潜在性危害的一种病害,常伴随烟草青枯病、黑胫病等根茎类病害混合发生,给烟叶生产带来毁灭性的损失。 镰刀菌属土壤习居菌,种类繁多,世界性分布,可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等。镰刀菌产孢能力很强,孢子传播途径很多,除土传外还可以通过空气传播,侵染植物维管束系统,破坏植物的输导组织。许多研究表明镰刀菌在植物的生长发育过程中还产生毒素,造成植物萎蔫死亡。镰刀菌病害在生产上属于防治最困难的重要病害之一,目前主要采用抗病育种及生物防治方法,但这些方法的使用因条件限制有一定程度的局限性。化学防治只能以预防为主,植物一旦受到侵染其治病效果甚微。只有充分认识到病原菌对植物的作用机理,才能找到最经济、有效、环保的防治措施。 镰刀菌引起的植物病害已受到世界范围的关注,但目前对镰刀菌的侵染机制研究仍处于探索阶段。该类病原菌在烟草上的相关研究极少,其对烟草的致病作用尚无相关报道。探求镰刀菌在烟草上的作用机理对未来烟草镰刀菌根腐病的防治工作有重要的意义。一直以来毒素都被认为是一类重要的致病因子,对植物组织有明显的损伤作用。本文针对镰刀菌产生的毒素进行了系统研究,以探明镰刀菌毒素在侵染烟草过程中的毒害作用。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 sariumso造林 本试验所用病原菌由山东烟田典型根腐病病株分离获得,经鉴定为茄病镰刀菌[Fusarium solani(Mart.)Sacc.]和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumSchlecht),菌株由中国农业科学院烟草研究所植保室王静老师提供。尖孢镰刀菌编号为f101,茄病镰刀菌编号为f90。 1.1.2 u3000g PDA:马铃薯300 g,葡萄糖20 g,琼脂18 g,蒸馏水1 L。 PSC培养液:蔗糖30 g,硫酸镁0.5 g,蛋白胨10 g,磷酸二氢钾1 g,硫酸亚铁0.01 g,氯化钾0.5 g,蒸馏水1 L。 1.1.3 试验材料 烟草(品种为‘红花大金元’和‘小黄金’)及其他作物种子包括大豆、豌豆、萝卜、白菜。 1.2 测试方法 1.2.1 psc的培养 供试f101和f90菌株分别在PDA平板上活化,打取直径为5 mm菌饼,并转接到盛有800 mL PSC培养液的1 L三角瓶内,每瓶32 片,置摇床25 ℃下振荡培养(120 r/min)15 d。培养液经纱布过滤后8 000 r/min离心15 min,弃沉淀留上清。该上清即为培养滤液,4 ℃保存备用。 1.2.2 毒素粗提物的溶解 乙酸乙酯萃取培养滤液,每次以1∶1的比例萃取3次,然后将3次萃取所得的有机相合并,旋转蒸发仪浓缩萃取液,得到毒素粗提物,用80 mL 100 ℃的无菌水溶解毒素粗提物。800 mL PSC培养滤液的提取物加80 mL无菌水制成的粗毒素液作为毒素原液(100%)。 1.2.3 德国考察中粗毒素的生物活性 1.2.3. 胚根长度测定 采用烟草种子发芽抑制试验测定粗毒素的活性。烟草种子经NaClO表面消毒,在28 ℃下催芽,待种子破壁露白后,摆在铺有毒素原液浸湿的滤纸的培养皿内,置于28 ℃恒温下,培养7 d,测量胚根长度。每处理每品种50粒种子,3次重复,清水处理为对照。 1.2.3. 两菌毒素的比 用两叶一心的‘小黄金’烟草幼苗,洗净根部经无菌处理后移入致病菌毒素的小试管内,毒素液共设5个浓度梯度,用毒素与无菌水的体积比依次表示为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、0∶1,48 h后观察幼苗发生萎蔫的时间与程度。每处理3株幼苗,3次重复。 1.2.4 对侧杆菌粗毒素的主观专化性 供试作物为大豆、豌豆、萝卜、白菜。测定方法同1.2.3.1。 1.2.5 幼苗生长试验 烟草种子常规消毒后播种,10 d后假植,30 d后取用。选取长势一致且健康的幼苗用于试验。浓度为50%的毒素浸泡挑选好的幼苗,间隔12 h取适量的幼苗用于试验,直至60 h停止试验。 1.2.5. 光合光密度值测定 称取幼苗根部1.0 g,剪碎,置于预冷的研钵中加适量的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)研磨成匀浆,4 ℃下8 000 r/min离心20 min,上清转入100 mL容量瓶中,残渣用磷酸缓冲液再提取一次,合并两次的上清,定容至刻度,低温保存。 配制反应混合液,0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)50 mL于烧杯中,加入愈创木酚28 μL,搅拌至愈创木酚溶解,最后加入30%的过氧化氢19 μL