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连钱草醇提工艺研究 连金草，又称江苏金草，是属于嘴唇科的血毒症性激活丹（nakai）kuber。2005年版药典一部收载该品种, 全国各地均有分布。具有利湿通淋, 清热解毒, 散瘀消肿的功效, 临床上用于治疗热淋、石淋, 湿热黄疸等疾病。文献报道连钱草含有黄酮、熊果酸、挥发油、无机盐等化学成分。结合文献, 以总黄酮、熊果酸及出膏率为指标, 采用正交试验优选最佳提取条件, 确定连钱草的醇提生产工艺。 1 材料和方法 1.1 naka草 甲醇为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。连钱草由江苏南京同仁堂药厂提供, 为唇形科植物活血丹Glechoma longituba(NaKai) Kupr.的干燥地上部分。 1.2 蒸发光散射法 贝克曼DU-640紫外分光光度计, Waters-2695型液相色谱仪, Alltech-2000型蒸发光散射检测器, Empower色谱工作站, 梅特勒百万分之一及万分之一电子天平。 1.3 标准物质 芦丁 (批号0080-9705) 、熊果酸 (批号110742-200314) 对照品均由中国药品生物制品检定所提供。 1.4 方法 1.4.1 正交实验的设计 根据文献报道及预试验结果, 选择乙醇提取, 影响乙醇提取的主要因素有乙醇浓度、加入乙醇量、提取时间、提取次数, 选用以上4个因素, 各取3个水平进行L9(34) 正交实验, 见表1。 1.4.2 样品溶液的制备 取连钱草50g, 根据已选定提取工艺条件提取, 每次提取后用纱布过滤, 滤液合并浓缩至500ml。 1.4.3 指标组成的测量 1.4.3. 检测曲线及方法 (1) 标准溶液的配制:精密称取120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品约20mg, 置100ml量瓶中, 加50%乙醇适量, 溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制成浓度约为0.2mg/ml的对照品溶液。 (2) 标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml, 分别置25ml量瓶中, 加水至6ml, 加5%亚硝酸钠溶液1ml, 混匀, 放置6min, 加10%硝酸铝溶液1ml , 摇匀, 放置6min, 加氢氧化钠试液10ml, 再加水至刻度, 摇匀, 放置15min, 以相应的溶液为空白, 照分光光度法, 在510nm波长处测定吸收度。 (3) 样品测定:精密量取样品液5ml, 稀释定容至50ml, 精密量取2ml, 平行两份, 按上法依法测定。 (4) 出膏率的测定:精密量取样品液10ml, 水浴蒸干, 于105℃干燥3h, 移置干燥器中, 冷却30min, 迅速称定重量。计算, 即得。 1.4.3. 熊乳酸对照品溶液 (1) 色谱条件: 色谱柱:汉邦Lichrospher5-C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm) , 柱温:30℃, 流动相:甲醇∶水∶冰醋酸 (83∶17∶0.1) , 流速:1.0ml/min, ELSD检测器漂移管温度:72℃, 气体流速1.9L/min。理论塔板数按熊果酸峰计算应不低于20000。 (2) 对照品溶液配制:精密称取减压干燥至恒重的熊果酸对照品适量, 制成浓度约为1mg/ml的对照品溶液。 (3) 样品制备:取正交提取液50ml, 回收至无醇味, 加乙酸乙酯萃取2次, 每次30ml, 提取液回收溶剂, 用甲醇溶解并稀释定容至10ml。 1.4.4 熊乳酸含量与总黄酮与出膏率的权重系数 选用总黄酮、熊果酸、出膏率为指标进行试验, 筛选最佳提取工艺。对正交实验3个评分指标, 采用综合评分法进行数据分析, 结合功效, 将熊果酸含量权重系数定为0.4, 总黄酮与出膏率的权重系数定为0.3。 熊果酸含量评分=熊果酸含量/最大熊果酸含量×0.4×100 总黄酮含量评分=总黄酮含量/最大总黄酮含量×0.3×100 出膏率评分=出膏率/最大出膏率×0.3×100 综合评分=熊果酸含量评分+总黄酮含量评分+出膏率评分 1.4.5 检查实验 取连钱草粗粉50g, 平行3份, 根据已选择的工艺提取制备。 2 结果 2.1 正交试验结果及离散度分析结果 见表2、3。 2.2 试验结果 见表4。验证实验结果表明, 所筛选的提取工艺基本稳定。 3 正交试验结果 3.1 实验结果表明, 影响熊果酸含量的因素依次为:ADBC, 最佳组合为A2B2C2D3;影响总黄酮含量的因素依次为DACB, 最佳组合为A1B3C3D3;影响出膏率的因素依次为:ADCB, 最佳组合为A1B3C2D3。 3.2 根据综合评分的极差及方差分析结果:乙醇浓度与提取次数各水平间差异有统计学意义, 其余因素差异均无统计学意义。提取的最优工艺为:A2B2C2D3, 根据实际生产, 确定连钱草的醇提工艺为:10倍量60%乙醇提取3次, 每次1h。 3.3 通过正交试验对连钱