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连钱草总三酸的分离纯化工艺研究 连草是嘴唇科多年生草本植物的活血丹[gleco]kupr。主要产于江苏省和浙江省。它具有润湿可洗、清热解毒、分散渣和囊肿的功效。现代医学表明,连钱草具有治疗胆固醇结石及抗炎作用。据有关文献报道,连钱草中主要含三萜酸类成分,如齐墩果酸、熊果酸等。笔者在本实验中以连钱草总三萜酸含量为指标,研究了AB-8大孔吸附树脂纯化连钱草总三萜酸的最佳工艺条件。 1 仪器和试剂盒 1.1 仪器 1.2 试剂 2 方法和结果 2.1 熊乳酸分光光度法 2.1.1标准品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品9.8 mg,置于100 mL量瓶中,加无水乙醇溶解后,定容至刻度,摇匀,即得0.098 mg·mL-1熊果酸储备液。 2.1.2显色方法 分别精密量取0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20,1.40 mL熊果酸储备液,水浴挥干,分别加5%香草醛-冰醋酸液0.4 mL、高氯酸0.8 mL,置60 ℃水浴加热10 min,冰浴冷却后,加冰醋酸5.0 mL摇匀,用紫外分光光度法在546 nm波长处测定其吸光度。 2.1.3标准曲线的绘制 以熊果酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得到标准曲线,其回归方程为:A=6.011 7C+0.093 3,r=0.999 5,线性范围为0.020～0.140 mg·mL-1。 2.2 树脂吸附特性 2.2.1树脂的预处理 树脂均先经95%乙醇浸泡充分溶胀,倒出乙醇及漂浮物,装填入适当的玻璃柱中,用95%乙醇反复冲洗至洗脱液无混浊出现。用纯化水反复冲洗,至无醇味,备用。 2.2.2三萜酸粗提液的制备 将连钱草粉碎至粗粉,用50%乙醇回流提取2 h,取滤液;同法再操作2次,合并滤液,浓缩成6.260 mg·mL-1连钱草总三萜酸粗提液。 2.2.3静态吸附与解吸 精密称取D101、AB-8、NKA-9 3种型号树脂各1.00 g,置于50 mL具塞锥形瓶中,加入6.260 mg·mL-1三萜酸粗提液10 mL,置于摇床,30 ℃振摇24 h,过滤,得滤液1,测其三萜酸浓度(C1)。取出吸附饱和的树脂,加入50%乙醇10 mL,同样温度条件下振摇24 h,再过滤,得滤液2,测其三萜酸浓度(C2)。分别以吸附率和解吸率为考察指标,观察各树脂的吸附性能。①吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100%;②吸附量=(C0-C1)×V/C0;③解吸率(%)=C2/(C0-C1)×100%。式中C0为粗提液原液浓度(mg·mL-1),C1为吸附后剩余溶液浓度(mg·mL-1),C2为洗脱液浓度(mg·mL-1),V为洗脱液体积(mL)。结果见表1。 2.2.4最佳树脂吸附等温线测定 精密称取AB-8大孔树脂1.00 g,分装于5个50 mL具塞锥形瓶中,分别加入不同浓度的连钱草三萜酸溶液10 mL,置于摇床,30 ℃振摇24 h,过滤,测定溶液中三萜酸的浓度。根据吸附平衡后吸附量与溶液中三萜酸浓度之间的关系,得到该树脂的吸附等温线,如图1所示。 由图1可见,吸附等温线是渐进线,这样的吸附行为符合Langmuir吸附等温线,可认为AB-8树脂吸附了连钱草三萜酸后便达到饱和而不能进一步吸附,故可认为AB-8对连钱草三萜酸为单分子层吸附。 2.2.5AB-8树脂的动态吸附实验 选用(20 mm×300 mm)的色谱柱,湿法装柱,以浓度为2.27 mg·mL-1,流速为2 BV·h-1,分步收集流出液,定时测定流出液中的三萜酸浓度,然后以洗脱液体积为横坐标,流出液中三萜酸含量为纵坐标,绘制动态吸附曲线。吸附达到饱和后,计算饱和动态吸附量(图2)。 从图2可见,AB-8树脂吸附浓度为2.27 mg·mL-1三萜酸料液时,从第2树脂床体积三萜酸就开始泄漏,但树脂床饱和吸附可达6 BV。在生产中可考虑采用树脂柱串联以充分发挥树脂的吸附性能。 2.2.6原液pH对树脂吸附性能的影响 pH主要通过影响三萜酸在水中的溶解度从而影响其吸附性能。实验中发现,三萜酸化合物在较低pH时,溶液呈絮状混浊状态,随着pH增高,溶液逐渐澄清,并且不同pH的浓缩液在色谱柱中的扩散速度也有明显差别,pH偏高或偏低均使扩散速度变慢(表2)。 由表2可看出,使用70%乙醇洗脱过程中,产物的纯度和洗脱率随着pH的变化而变化,在pH=6时,产物的洗脱率达到最大。实验中发现,pH较大和较小时,浓缩液在树脂上部形成絮状沉淀,堵塞严重,严重影响洗脱效率。因此,pH=6较为适宜。 2.2.7乙醇浓度对AB-8树脂洗脱效果的影响 洗脱剂具有使大孔树脂溶胀,减弱被吸附物质与树脂之间的吸附力的作用,并可溶解被吸附物质。在原液pH=6下,以乙醇作为洗脱剂进行解吸附的洗脱效果见表3。 可见,95%乙醇的洗脱率最高,但70%乙醇洗脱获得产物的纯度最高,综