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不同温度和时间下荷斯坦种牛细管冻精品质的变化 牛和羊的冷冻储存技术主要始于20世纪50年代。colga等人使用甘油作为冷冻保护剂，将牛样品储存在-79c下，并将其运输到国外。这是世界上第一个冷冻的牛。现在养牛业中,已广泛应用冷冻精液人工授精,该技术极大地促进了牛生产性能的改进和新品种的培育。目前对牛、羊冷冻精液的研究多集中在冷冻方法上,对解冻方法研究不多,而解冻温度和解冻时间对解冻后精液品质也有极大的影响,同样制约着输精后的受胎率。本研究通过不同解冻方法对牛细管冻精进行解冻,目的是寻找最佳解冻温度和解冻时间,从而提高精子解冻后的活率和受胎率。 1 材料和方法 1.1 精的检测和密度 随机从西安市种公牛站选用5头荷斯坦种公牛,采精后,对鲜精进行品质检测,选择活率达到70%以上,精子密度在20亿个/mL以上的精液用于冷冻。从选用的每头种公牛的0.25 mL冻精细管中随机选12支用于研究,共计60支。 1.2 解冻时间及其构成 试验采用二级系统分组模式设计。解冻温度作为一级因子,设4个水平,即5,15,37,75 ℃。解冻时间作为二级因子设12个处理,分别为5 ℃(60,90,120 s),15 ℃(20,40,60 s),37 ℃(10,20,30 s ),75 ℃(2,4,6 s)。每个处理5个重复。 1.3 精子形态观察 活率及存活时间的评定 按照不同的解冻方法解冻后,立即取1~2滴精液滴在事先预热的载玻片上,置于显微镜下37 ℃恒温载物台上,测定活率。剩下的精液注入盛有1 mL质量分数2.9%柠檬酸钠溶液的试管中,放入37 ℃恒温水箱内孵育记录精子存活时间。开始每隔1 h观测1次活率,当精子活率降低一半时,间隔30 min观测1次活率,直到精子全部死亡,记录精子存活时间。 精子形态的观察 将解冻后的精液滴于载玻片上,用姬姆萨染色法染色。每个处理各做2张切片,在1 000倍油镜下观察精子形态,顶体损伤主要表现为顶脊边缘不光滑,肿胀如月牙状突起或向后翻转,形成皱褶;顶体内出现空泡,表面凹凸不平,顶体破裂,碎片掉落。畸形主要为头部畸形(长形头、梨形头、巨形头)和尾部畸形(尾部卷曲、弯曲)。每个切片记数200个精子,计算其顶体正常率和畸形率。 1.4 数据计数 采用二级系统分组资料进行方差分析,以百分数表示活率,顶体正常率和畸形率在方差分析前均经反正弦转换。各组均数间用新复极差法进行检验。 2 结果与分析 2.1 精神活率 2.1.1 不同的冻精解冻实验结果 不同解冻温度解冻后精子活率如表1所示。 随着解冻温度升高,解冻后精子活率也升高。37和75 ℃下冻精解冻后的活率显著高于5和15 ℃(P0.05)。75 ℃解冻后冻精活率最高,达到41%,5和15 ℃解冻后活率差异不显著,均低于25%。 2.1.2 解冻前后活率比较 同一解冻温度下解冻时间长短不同,精子的活率也不同(表1)。低温、室温(5和15 ℃)解冻后活率差异不显著(P0.05)。而较高温度(37和75 ℃)下解冻,不同解冻时间差异显著(P0.05)。 2.2 解冻精子细胞 解冻温度、时间对精子顶体正常率、畸形率的影响见表2。在油镜1 000倍显微镜下观察精子形态,75 ℃解冻时的顶体正常率(68.14%)显著高于5,15,37 ℃解冻时的顶体正常率(P0.05),而精子畸形率(8.63%)显著低于5,15,37 ℃时解冻的畸形率(P0.05),且后三者之间差异不显著(P0.05)。结果(表2)还表明,37 ℃10 s,75 ℃2 s解冻后,精液的温度达到5 ℃;37 ℃ 20和30 s,75 ℃ 4和6 s相当于将精液温度升至35~37 ℃。在5 ℃和室温条件下解冻,精子细胞通过致死温区的时间长,冰晶造成的损伤和溶液效应对膜结构的破坏均较严重。在本试验中,75 ℃解冻精子越过危险温区的速度快,对精子细胞损伤小。同时在较高温度(37和75 ℃)时,解冻时间间顶体正常率和畸形率差异不显著,低温下,随着解冻时间的延长,畸形率降低,顶体正常率也有上升的趋势,但差异不显著。 2.3 两组生存时间比较 精子的存活时间是影响受胎率的一个重要因素。存活时间随解冻温度升高而延长,比较各组存活时间可以看出:75 ℃37 ℃15 ℃5 ℃。由表1可见,除5 ℃解冻120 s的存活时间长于5 ℃解冻60 s,90 s及75 ℃解冻6 s的精子细胞存活时间长于75 ℃解冻2 s和4 s外,其余各处理之间差异均不显著。 3 不同冷冻温度和高温解冻精子细胞的活率 目前,英 、法、日、墨西哥、印度等国家采用的低温(5 ℃)缓慢解冻,新西兰、芬兰、瑞典、澳大利亚使用的室温(15 ℃)中速解冻,匈牙利、比利时、前苏联等20多个国家采用37~40 ℃体温快速解冻,挪威等国采用75 ℃高温超快速解冻,均取得了