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乙酰丁香酮在农杆菌遗传转化中的应用 作为一种自然植物遗传转化体系，农杆菌的遗传转化具有转化外源dna结构完整、转化机制清晰、整合位点稳定、破碎率低、融合后外源遗传结构变化小等优点。已成为植物转世策略的首选，建立高效的遗传转化体系已成为一个非常重要的研究领域。 研究证明,宿主植物细胞能分泌某些酚类化合物,可诱发农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上Vir区基因的活化和高效表达,促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移,从而提高遗传转化效率。其中常用且诱导效果最佳的是乙酰丁香酮(AS),由Stachel等从代谢活跃的烟草根、叶愈伤组织的提取物中分离得到。近年来,AS被广泛应用于植物遗传转化中,取得了较好的效果,使得农杆菌介导的遗传转化方法更加完善。笔者简要综述了AS提高植物遗传转化率的作用机理、影响因素及其应用,并提出了自己的一些见解,为提高AS在遗传转化中的使用效率提供一些参考。 1 as诱导酚类化合物作用机理 植物和微生物可以通过一些化学物质分子,以化学的方式发生相互作用。早在1984年,Shaw等的试验表明,农杆菌对酚类化合物具有趋化性,而且这种趋化性依赖于virA和virG基因。Stachel等发现烟草叶子的受伤部分比非受伤叶子具有明显的诱导作用,并从受伤植物细胞中分离提取出了AS,将其作为趋化物来识别。近年来,随着研究的深入,AS的作用机理也越来越清楚,为AS在遗传转化中的应用和遗传转化率的提高奠定了基础。 AS作为诱导性最好的酚类化合物,其作用机理主要是通过诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达,促进T-DNA的加工与转移,从而使农杆菌T-DNA更易进入植物基因组并与其整合。农杆菌Ti或Ri质粒的Vir区编码产物负责接收外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能,对菌种的侵染力起决定性的作用。农杆菌在生长培养基中培养繁殖时,所有的Vir区基因均处于非转录活性状态,这些基因接受AS等信号分子后便开始转录活化。virA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白,其蛋白的胞质区有自激酶的功能,可自我催化使其474位保守的组氨酸残基磷酸化,virA蛋白从而被激活。磷酸化的virA蛋白进而将其磷酸基转移到virG保守的天冬氨酸残基上,使virG蛋白活化,活化的virG蛋白以二体或多体的形式结合到其他Vir区基因启动子的特定区域,从而激活其他vir基因的转录,产生T-DNA切割、包装、转移所需的功能蛋白。 酚类化合物的诱导效果与其分子结构有很大关系,这也是AS诱导效果最强的原因。对与AS相近的一些化合物的检验表明,苯环上3、5 2个位置上的碳原子都结合甲氧基的化合物比只含1个甲氧基的化合物具有更强的诱导性。Melchers等进一步研究了大量的与AS相近的化合物,发现这些化合物均遵守一个化学“规则”,即通常情况下,最强的诱导物在其苯环上含有一个愈创木脂或丁香酮取代基,还有一个羟基电子群。AS的分子结构见图1。 2 影响as效果的因素 遗传转化是多因素调控、非常复杂的体系,AS作为一种诱导Vir区基因活化的物质,在使用过程中会受到多种因素的影响。 2.1 补充as与农杆菌 AS是常用的诱导性最强的酚类化合物,虽然被广泛用来提高遗传转化率,但在不同植物种类上应用效果不同。AS是双子叶植物细胞壁合成的前体,一般认为细胞渗出液中含有 0.5~1.0 μmol/L的AS即可诱导农杆菌Vir区基因活化,但最适诱导浓度要更高。因此,大多双子叶植物的遗传转化仍需补充AS以提高转化率,也有少数双子叶植物在受伤的组织中可以产生一些酚类物质,这些酚类物质已能起到活化vir基因的作用,所以在遗传转化中加入AS转化效率并没有明显提高。 单子叶植物对农杆菌的敏感性一般要比双子叶植物差,转化较困难,但最近大量的研究表明,部分单子叶植物在转化时使用AS能使转化率明显提高。以前认为根癌农杆菌不易感染单子叶植物,是因为农杆菌不能吸附到植物细胞的表面,或者是由于单子叶植物细胞中生长素和细胞分裂素平衡异常。但Graves等的扫描电镜观察表明,农杆菌能够以在双子叶植物中相同的方式结合到单子叶植物细胞的表面。所以农杆菌被认为不能转化单子叶植物的原因,可能是转化频率太低,或者是单子叶植物内缺乏足够数量的信号分子。现在发现,在某些单子叶植物中也能产生酚类化合物,如玉米、斑心吊兰、山药和唐菖蒲等,这些单子叶植物都能被农杆菌感染。而对于一些不易被农杆菌感染的植物,如果在转化过程中加入AS等酚类化合物,也有可能被农杆菌感染。 2.2 as的浓度 AS难溶于水,需使用溶剂才能溶解。一般用于拟蓝芥花侵染的,配制使用的溶剂为DMSO;用于愈伤组织侵染的,则用少量甲醇溶解后再用蒸馏水定容。AS的贮存液需过滤灭菌,并且在培养基温度小于60 ℃时加入。 在众多研究中,AS的有效使用浓度一般在50~200 μmol/L,