五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍的保护作用.docxVIP

五子衍宗汤对环磷酰胺致小鼠生精障碍的保护作用 五子衍宗汤由枸杞、兔蚕丝、五味子、覆盆子和香蕉籽组成。具有补肾益精、补精补髓的功效。主要用于肾衰竭、阳痿、早泄和长期不育。它通常用于治疗男性不育。然而，五子衍宗汤是否对抗旱药物引起的生精障碍的药理作用尚不清楚。 1 材料和方法 1.1 样品的提取 五子衍宗汤由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成, 全部生药经三峡大学医学院汪鋆植教授鉴定为正品。按照传统方法煎药, 浓缩至粉末, 提取率为18.8%, 临用前配成相应浓度的溶液;注射用环磷酰胺, 规格为0.2g, 批 江苏恒瑞医药股份有限公司。 1.2 实验动物及生产许可证 Bal B/c种雄性小鼠, SPF级, 8~9周龄, 22 g~25 g, 湖北省实验动物中心提供, 动物生产许可证号SCXK (鄂) 2008-0005。 1.3 酚红素f-1.3.4%的酚红 Bouins液:苦味酸饱和水溶液750 m L, 甲醛250 m L, 冰醋酸50 m L。精子营养液:BWW (Na Cl0.554 g/L、KCl 0.0356 g/L、Ca Cl20.025 g/L、KH2PO40.0162 g/L、Mg SO4·7H2O 0.0294 g/L、Na HCO30.210 g/L、Na Pyr 0.003 g/L、Nalac 0.370 g/L、Glucose 0.100 g/L、质量分数0.5%的酚红1.0 m L、青霉素10000 U、质量分数0.3%的BSA。其余药品均为分析纯。 1.4 多功能显微及图像分析系统 SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪, 武汉千屏影像技术有限责任公司;DMR型多功能显微镜及图像分析系统, 德国Leica公司;H-7500型透射式电子显微镜, 德国Leica公司;ULTRACUT R型超薄切片机, 奥地利莱卡公司;JA2003型电子分析天平, 上海天平仪器厂。 1.5 方法 1.5.1 连续注射环磷酰胺水解反应 32只Bal B/c雄性小鼠, 随机分为4组, 依次为空白对照组、模型组、五子衍宗汤低剂量组、五子衍宗汤高剂量组。除空白对照组外, 其余小鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg, 连续注射7d, 空白对照组腹腔注射等量生理盐水。空白对照组和模型组每天灌服1%羧甲基纤维素钠0.2 ml, 五子衍宗汤低剂量组给予五子衍宗汤2 g/kg, 五子衍宗汤高剂量组给予五子衍宗汤4 g/kg, 各组小鼠连续给药35d。 1.5.2 大鼠生殖器官的重量测量 1.5.3 精子浓度的测定 将盛有6ml精子营养液的试管置于恒温水浴箱预热至37℃, 取单侧附睾去除脂肪, 剪碎放入试管中摇匀, 37℃保温10min~15min, 使精子充分游离, 接着取1滴滴入牛鲍氏血细胞计数板上, 计算每毫升精子数。用微量移液器吸取10μl精子悬液, 利用SQIAS-2000彩色精液质量图文分析仪进行精子活率测定。 1.5.4 独立液液的制备 取单侧睾丸去除包膜、剪碎, 置于3ml p H 7.4的PBS试管中, 于漩涡震荡混合器上混合3min, 组织细胞液用200目尼龙网过滤于试管内, 1500r/min离心5min, 弃上清将沉淀悬浮后加3ml PBS, 混匀1 min, 同样条件重复洗涤2次, 制成单细胞悬液。PBS调整细胞浓度至106~107个/ml 4℃、70%乙醇固定2 h后, 低速短时离心去除固定液, PBS洗2遍, 加40μg/ml的RNA酶400μl, 于37℃水浴30min, 加入100μl PI染液混匀, 4℃避光染色30 min即可上机进行检测, 计算出不同倍体细胞的百分比。 1.5.5 睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布 取单侧睾丸石腊切片, HE染色, 光镜观察睾丸组织内精原细胞与各级生精细胞的分布情况。环氧树脂包埋, 做超微切片, 电镜观察睾丸组织内曲细精管及各级生精细胞超微结构的变化。 1.5.6 统计处理 数据经SPSS 13.0软件处理, 实验各个指标均用均数±标准差表示, 各组均数之间比较进行one-way ANOVA检验。 2 结果 2.1 五子衍宗汤对大鼠睾丸和附件的影响 表1显示, 模型组小鼠睾丸重量和附睾重量显著低于空白对照组, 五子衍宗汤低、高剂量均可增加小鼠的睾丸及附睾重, 但无显著性差异。 2.2 水平空白对照组 表2显示, 模型组小鼠精子密度、精子活率显著低于空白对照组。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增加生精障碍小鼠的精子密度。五子衍宗汤低、高剂量对生精障碍小鼠的精子活率也有一定的提升作用。 2.3 细胞配比 表3显示, 模型组小鼠1C和4C细胞百分比显著下降, 2C细胞百分比相对升高。五子衍宗汤低、高剂量均可显著增性恢复生精障碍小鼠各级生精细胞的百