芍药苷、马钱苷与牛血清白蛋白的相互作用研究.docxVIP

芍药苷、马钱苷与牛血清白蛋白的相互作用研究 血清蛋白质是血浆中最丰富的载体蛋白。蛋白大和药物的相互作用是相对稳定的结合部位，并随着一定程度的空间构象变化。而药物进入人体必须通过血浆的储运才能到达受体部位并产生药效,因此研究药物分子与蛋白的相互作用有利于从分子水平了解药物的作用机理。采用荧光光谱等方法研究药物与牛血清白蛋白(BSA)的相互结合作用已有报道,这对于理解BSA的运输作用机制,以及对新药的设计具有指导意义。 芍药苷(paeoniflorin)是一种双环单萜苷类化合物,具有抗炎、保肝、镇痛、镇静、免疫调节等药理活性,为中药牡丹皮、白芍、赤芍等的活性成分之一。马钱苷(loganin)是一种环烯醚萜苷类化合物,具有降血糖、增强免疫、抗炎、抗休克、利尿、降压等作用,在山茱萸等中药材中含量较高。目前国内外未见牛血清白蛋白与芍药苷、马钱苷相互作用的研究报道。 本文采用荧光猝灭法、同步荧光光谱法和紫外光谱法研究了生理条件下芍药苷和马钱苷与牛血清白蛋白的相互作用,通过计算2种苷类分子与BSA的热力学参数,推`测芍药苷和马钱苷与BSA的相互作用机理。本研究对于阐明芍药苷与马钱苷在人体内的运输及作用机制具有重要意义。 1 u3000药品、制剂与标准储备液的配制 Cary eclipse型荧光分光光度计(美国瓦里安公司),TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析仪器有限责任公司),XS205 DualRange分析天平(美国梅特勒托利多公司),PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂),移液枪(20 μL),81-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)。 牛血清白蛋白(Sigma,纯度≥98%),相对分子质量为6.60×104。BSA标准储备液的配制:准确称取BSA 6.60 mg,用去离子水溶解并定容至10 mL量瓶中,即得1.0×10-5mol·L-1的溶液,置于4 ℃冰箱中保存。化学对照品芍药苷、马钱苷(中国药品生物制品检定所)用乙醇分别配制成1.662×10-3mol·L-1和1.332×10-3mol·L-1的储备液,水为去离子水。其他试剂均为国产分析纯。 2 荧光光谱的测定 于10 mL量瓶中依次加入0.5 mol·L-1氯化钠溶液2 mL、pH=7.4的Tris-HC1缓冲溶液2 mL、BSA标准储备液2 mL,用去离子水稀释至刻度,摇匀。取该溶液2 mL置于1 cm的荧光比色皿中,以280 nm为激发波长,激发光谱狭缝与发射光谱狭缝宽度为5 nm,在300～500 nm范围内扫描荧光发射光谱。逐次将马钱苷储备液(或芍药苷储备液)加入比色皿中,置25 ℃或37 ℃恒温水浴中(内置微型磁力搅拌器)搅拌5 min,以Δλ=60 nm和Δλ=15 nm测定其同步荧光光谱(激发光栅及发射光栅狭缝宽均为5 nm),同时对该溶液的紫外光谱进行测定。由于加入药物的累加体积远小于荧光池中溶液的原始体积,故实验中忽略加入的药物体积对浓度的影响。 3 结果与讨论 3.12 相同条件下合成对bsa的影响 蛋白质的天然荧光及其变化在一定程度上反映了蛋白质分子中荧光发色团本身及周围微环境的变化,因此可以通过荧光光谱的变化推测小分子与蛋白质相互作用的机制。图1为25 ℃温度下BSA和BSA-芍药苷复合物的荧光猝灭光谱。由图可知,芍药苷的加入没有导致新荧光峰的产生,且随着溶液中芍药苷浓度的增加,BSA的内源性荧光强度有规律地降低,峰位置和峰形基本保持不变;相同条件下马钱苷对BSA的荧光猝灭作用与芍药苷类似(见图2)。可见,芍药苷或马钱苷与BSA间存在相互作用,并引起蛋白质微环境及构象的改变。 图3为芍药苷、BSA和BSA-芍药苷复合物的紫外吸收光谱图。由图可见,随着小分子药物浓度的增加,溶液吸收峰(280 nm)的吸收度增大,且谱图的形状发生了一定的改变,说明小分子与BSA之间发生了相互作用。在BSA中加入芍药苷后,吸收峰位置蓝移,蓝移的发生说明体系的疏水性增加。相同条件下马钱苷对BSA的紫外吸收光谱的影响参见图4,可以看出,马钱苷对BSA的作用与芍药苷类似。以上结果验证了芍药苷或马钱苷和BSA的基态分子之间的相互作用。 3.2 stern-微织构物对bsa的荧光u 荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭、静态猝灭和发生非辐射能量转移。根据结合常数KSV可判断静态猝灭还是动态猝灭作用。动态猝灭依赖于扩散,升高温度导致扩散加快,因此KSV将随着温度的升高而增大;若是静态猝灭,升高温度会导致配合物稳定性降低,因此KSV将随温度的升高而减小。由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态,因而并不改变荧光物质的吸收光谱;而在静态猝灭中,基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。 若芍药苷和马钱苷对BSA的荧光猝灭为动态猝灭,则作用过程应遵循Stern-Volmer