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诺氟沙星与卵清蛋白相互作用的研究 诺氟沙星与ova间的相互作用 蛋白质是生物中不可或缺的活性物质。 关于蛋白质的研究一直是科研工作者感兴趣的内容。 蛋白质与内源性化合物及许多药物分子之间可以发生相互作用而结合为复合物。 目前, 光谱法在这方面的研究主要针对血清白蛋白, 对于其他蛋白质的研究很少。 从不同角度考察不同蛋白质与药物之间的相互作用对于更全面地了解药物的转运和代谢过程以及阐明蛋白质与药物小分子相互作用的化学本质都具有非常重要的意义。 卵清蛋白 (Ovalbumin, OVA) 是单体磷糖蛋白, 由于卵清蛋白具有较好的起泡性、 亲水性和乳化性能, 加热后又易形成凝胶, 而被广泛应用于婴儿食品、 肉加工业、 面包和甜点制造业中。 诺氟沙星 (norfloxacin, NRF) 是第三代喹诺酮类合成抗菌药, 对革兰阴性菌、 金黄色葡萄球菌有很强的杀菌作用。 本文应用荧光光谱法研究了不同酸度, 不同温度条件下诺氟沙星与卵清蛋白的相互作用, 利用诺氟沙星对蛋白质荧光的猝灭求出了诺氟沙星与卵清蛋白的结合常数和结合位点数, 并计算了它们之间相互作用的热力学参数。 同时还利用紫外吸收光谱法考察了诺氟沙星对OVA构象的影响。 这对阐明蛋白质与药物之间的作用方式有一定的指导意义。 1 实验部分 1.1 phs-2ca型精密酸度计 RF-540型荧光分光光度计 (日本岛津公司) , Lambda-17型紫外-可见分光光度计 (美国Perkin-Elmer公司) , PHS-2C (A) 型精密酸度计 (上海大普仪器有限公司) 。 卵清蛋白 (OVA, 联星生物公司) 1.0×10-4mol·L-1储备液, 诺氟沙星 (河南天方药业股份有限公司提供) : 2.0×10-3mol·L-1水溶液, 缓冲溶液pH值分别为5.8, 7.4的磷酸盐缓冲液, pH值为8.4的Tris-HCl缓冲液 (均含0.01 mol·L-1的NaCl) 。 所有试剂均为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水。 1.2 荧光光谱的测定 将一定量的OVA与NRF溶液依次加入到10 mL容量瓶中, 以相应的缓冲溶液稀释至刻度, 混匀, 于水浴中恒温。 测定荧光发射光谱的激发波长为280 nm, 扫描范围为300～500 nm。 将一定量的OVA与NRF溶液依次加入到10 mL容量瓶中, 以相应的缓冲溶液稀释至刻度, 混匀。 以相应的NRF溶液为参比, 测定紫外吸收光谱。 2 结果与讨论 2.1 荧光nrf荧光文化遗产的荧光实物 蛋白质中因含有色氨酸 (Trp) 、 酪氨酸 (Try) 、 苯丙氨酸 (Phe) 等氨基酸残基而产生较强的内源荧光, NRF在与OVA相互作用过程中能猝灭OVA的荧光强度。 图1为30 ℃, pH 7.4时NRF猝灭OVA的荧光发射光谱。 激发波长为280 nm时, 蛋白质分子中色氨酸残基和酪氨酸残基的最大荧光强度的波长分别位于约340和300 nm左右。 由图可以看出, 随着溶液中NRF浓度的增大, OVA在338 nm处的荧光发射峰出现了明显的猝灭现象, 说明蛋白质与NRF结合使色氨酸周围的微环境发生了改变, OVA分子的空间构象也发生了变化。 从图中还可看出, 随着NRF浓度的增加, 在蛋白质荧光猝灭的同时, 荧光发射峰的峰位也出现了明显的红移现象, 说明色氨酸的亲水性增加。 对于NRF, 激发波长为280 nm时, 在约415 nm处有荧光发射峰, 当不断增加NRF浓度时, 发射峰强度不断增加。 一般情况下, 荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭和静态猝灭。 荧光猝灭数据通常用Stern-Volmer方程来进行分析 F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)F0/F=1+Κqτ0[Q]=1+ΚSV[Q](1) 式中:F0和F分别是不存在和存在猝灭剂时的荧光强度;Kq为双分子猝灭过程速率常数,τ0为无猝灭剂时荧光体的荧光寿命, 对于生物大分子,τ0=10-8s, [Q]是猝灭剂的浓度;KSV称为Stern-Volmer猝灭常数。 根据Stern-Volmer方程, 以F0/F对[Q]作图, 由直线斜率可得到NRF对OVA的猝灭速率常数Kq为6.31×1012L·mol-1·s-1。 由于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散控制的碰撞猝灭速率常数为2.0×1010L·mol-1·s-1, NRF对OVA的猝灭速率常数Kq远大于这一数据, 表明此体系的猝灭过程不是由于分子扩散和碰撞而引起的动态猝灭, 而是分子之间形成了化合物而引起的静态猝灭。 2.2 模式2:动态符合信息模型的f0/f[q] 分别测定了30和45 ℃ pH为7.4条件下NRF对OVA的荧光猝灭光谱。 根据Stern-Volmer方程, 作两个温度下的F0/F～[Q]图 (见图2)